2026-09-02
Здравствуйте, сегодня я хочу поделиться с вами статьёй, опубликованной в 2024 году Джон Сук Джин и др. под названием «Хлорид кальция как новый стабилизатор вируса ящура и его применение в составе вакцины».
Аннотация: В данном исследовании была проведена оценка термостабильности вирусов ящура (FMDV) типов O и A, в результате чего было установлено, что вирус штамма Jinchuan типа O обладает наименьшей термостабильностью. Для решения этой проблемы нестабильности в данном исследовании предложено использовать хлорид кальция в качестве нового стабилизатора. Результаты исследования показывают, что при концентрации хлорида кальция 10 мМ термостабильность вируса ящура достигает максимального уровня, тогда как при концентрации свыше 30 мМ наблюдается тенденция к снижению термостабильности. При хранении вируса штамма «Цзиньчуань» типа O при температуре 4 °C количество антигена со временем значительно уменьшается; в то же время образцы, обработанные хлоридом кальция, позволяют стабильно сохранять вирус без заметной потери антигена. После двукратной вакцинации свиней вакциной, содержащей хлорид кальция, титр нейтрализации вируса достиг примерно 1:1000, что свидетельствует о способности данной вакцины защищать свиней от заражения вирусом ящура. Таким образом, несмотря на низкую стабильность вируса штамма «Цзиньчуань» типа O в процессе хранения после производства антигена, после обработки хлоридом кальция этот вирус может быть легко использован для приготовления вакцины. В данном исследовании оценен потенциал хлорида кальция в качестве нового стабилизатора вакцины против ящура, что способствует разработке стабильных вакцинных препаратов.
Ключевые слова: вирус ящура; вакцина; хранение; стабилизатор; хлорид кальция
1. Введение. Ящур (FMD) — это высокозаразное вирусное заболевание, поражающее в основном парнокопытных животных и представляющее серьезную угрозу для мирового животноводства. Его возбудителем является вирус ящура (FMDV), относящийся к семейству малых РНК-вирусов и обладающий одноцепочечной РНК длиной около 8500 нуклеотидов. Вирус ящура имеет 7 иммунологически различных серотипов (O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 и SAT3), а также, ввиду его генетического разнообразия, существует множество подтипов. РНК-геном вируса ящура содержит 4 структурного белка (P1, VP4, VP2, VP3 и VP1) и 8 неструктурных белков (L, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C и 3D). Среди них белки VP1, VP2 и VP3 участвуют в формировании поверхности вируса, представляя множество антигенных эпитопов, а белок VP4 стабилизирует вирусную РНК внутри капсида. Каждый структурный белок (SP) соединяется с другими, образуя протополимер (12S); пять протополимеров собираются в пентамер (75S), а 12 пентамеров далее образуют полые капсиды (75S) и вирусные частицы (146S).
Разработка эффективной вакцины против ящура имеет решающее значение для сдерживания распространения вируса; многие страны уже внедрили политику вакцинации против ящура, чтобы предотвратить широкомасштабные вспышки заболевания, сократить экономические потери и обеспечить безопасность международной торговли животными. Однако физические свойства вируса ящура делают его крайне чувствительным к таким условиям окружающей среды, как температура и pH, что создает сложности при разработке вакцин против ящура. В частности, частицы 146S вируса ящура легко повреждаются в слабокислых условиях или при высоких температурах, в результате чего они диссоциируют на субъединицы-пентамеры, причем остатки гистидина на границе раздела между пентамерами играют ключевую роль в этом процессе. Имеющиеся исследования показывают, что диссоциированные субъединицы 12S обладают низкой иммуногенностью и вызывают слабый нейтрализующий иммунный ответ. Такая физическая нестабильность вируса ящура в конечном итоге приводит к снижению эффективности вакцины и сокращению срока хранения, поэтому разработка добавок, способных повысить стабильность вируса ящура, имеет большое значение.
В имеющихся исследованиях описаны различные стабилизирующие добавки, применимые к различным типам вирусов, включая вирус ящура, такие как дисахариды, аминокислоты, детергенты, ионы металлов и т. д., а во всем мире ведутся исследования по стабилизации вируса ящура путем замены аминокислот в белках вирусной оболочки. В частности, было обнаружено, что ионы двухвалентных переходных металлов способствуют стабилизации вирусных частиц за счет образования солевых мостиков на границах между пятимерами капсида вируса ящура, причем эта способность зависит от таких факторов, как штамм вируса. Кроме того, имеющиеся исследования подтверждают, что двухвалентные катионы способны стабилизировать вирус полиомиелита. Эти предыдущие исследования позволили добиться определённого прогресса в повышении стабильности вируса, однако пока не оценивалось, сохраняется ли содержание вакцинного антигена после длительного хранения в водной фазе, а также влияют ли вспомогательные вещества на иммуногенность вакцины.
Среди семи серотипов вируса ящура серотип O является наиболее широко распространенным во всем мире. В Азии были зарегистрированы вспышки заболевания, связанные с серотипами Юго-Восточной Азии (линия SEA/Mya-98), Ближнего Востока и Южной Азии (линии ME-SA/Pan-Asia и Ind 2001), а также с топологическим типом Cathay. Исследования показывают, что стабильность вируса ящура серотипа O ниже, чем у других серотипов. Аналогичным образом, в наших предыдущих исследованиях было подтверждено, что вирус серотипа O штамма Чинчхон (линия SEA/Mya-98), выделенный в Южной Корее, обладает заметной нестабильностью и чрезвычайно подвержен инактивации. Для решения этой проблемы мы разработали стабилизатор SLA, представляющий собой смесь сахарозы и гидролизата сывороточного белка. Однако, поскольку данный состав может способствовать росту микроорганизмов, он подвержен загрязнению бактериями и грибами даже при хранении при температуре 4 °C, а также приводит к образованию белковых осадков. Поэтому мы сосредоточили свои усилия на поиске нового стабилизатора, способного заменить SLA, и обнаружили, что кальций способен повысить физическую стабильность вируса типа O (штамм Чинчхон).
Целью данного исследования является изучение собственной термостабильности вируса ящура и повышение стабильности нестабильных штаммов вируса ящура с помощью хлорида кальция в качестве стабилизатора, а также оценка пригодности хлорида кальция в качестве добавки к вакцине против ящура.
2. Материалы и методы 2.1 Клетки и реагенты Суспензионные клетки почек молодых хомяков-21 (BHK-21) были получены Управлением по карантину животных и растений Республики Корея и Институтом биологических наук и биотехнологий Республики Корея на основе исходной адгезивной клеточной линии BHK-21 в безсывороточной среде. Суспензионные клетки культивировали в среде CellVento в инкубаторе с встряхиванием при 37 °C и 5 % CO₂. Хлорид кальция растворяли в дистиллированной воде с получением 300 мМ запасного раствора для дальнейшего использования.
2.2 Вирусы В данном исследовании использовались 8 штаммов вируса ящура, в том числе 5 штаммов, выделенных в Южной Корее: O/SKR/Чинчхон/2014, O/SKR/Андон/2010, O/SKR/Боон/2017, A/SKR/Рёнчхон/2017 и A/SKR/Пхочхон/2010; а также 3 генетически модифицированных штамма, полученных путем замены гена в области P1 штаммов O1/Маниса/ Турция/69, O PanAsia-2, O/Тайвань/97 и A22/Ирак/24/64 в области P1; подробности метода конструирования приведены в ранее опубликованных работах. Суспензионные клетки BHK-21 культивировали в среде CellVento в течение 3,5 дней, после чего добавляли 30 % (об./об.) свежей среды CellVento и инокулировали вирусом ящура. Через 16–20 часов после заражения вирус собирали, удаляли клеточные фрагменты центрифугированием при 3000×g в течение 20 минут и получали прозрачную вирусную суспензию. Вирусную суспензию обрабатывали диэтилендиамином (BEI) до конечной концентрации 3 мМ для инактивации вируса ящура; затем добавляли 2 % (об./об.) натрия тиосульфата для нейтрализации BEI.
2.3 Очистка 146S-частиц вируса ящура В прозрачный образец вируса ящура добавляют 7,5 % полиэтиленгликоля 6000 для концентрирования вирусных частиц. Концентрированный вирусный антиген помещают в центрифужную пробирку, содержащую плотностной градиент сахарозы (SDG) 15–45 %, и подвергают ультрацентрифугированию при 100 000 × g в течение 4 часов при 4 °C. После центрифугирования образцы подвергают фракционированию с помощью устройства для непрерывного плотностного градиентного фракционирования. Поглощение каждой фракции измеряют с помощью спектрофотометрического модуля при длине волны 254 нм. Следуя методу, описанному в предыдущих исследованиях, содержание вирусных частиц 146S (мкг/мл) рассчитывают по площади пика в определенном фракционном слое. Фракцию, содержащую частицы 146S, собирают и повторно центрифугируют при 100 000 × g в течение 4 часов при 4 °C. Полученный вирусный осадок ресуспендируют в буфере Tris-KCl (pH 7,6).
2.4 Количественное определение антигена вакцины против ящура Количественное определение вакцинного антигена в образцах вируса ящура, очищенных с помощью ускоренной центрифуги, проводили с помощью размерно-исключающей высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC). Вкратце, в данном исследовании использовалась гелевая колонка TSKgel G4000PWXL (300 мм × 7,8 мм, внутренний диаметр) в комплекте с защитной колонкой TSKgel PWXL (40 мм × 6,0 мм). Для измерения поглощения на длине волны 254 нм использовалась система Agilent 1260 Infinity II. Рабочая фаза состояла из 30 мМ Tris-HCl и 400 мМ NaCl (pH 8,0), скорость потока составляла 0,5 мл/мин. В соответствии с методами предыдущих исследований количественное определение частиц 146S вируса ящура проводилось путем расчета площади под пиком целевого компонента.
2.5 Определение термостабильности вируса ящура Определение термостабильности вируса ящура проводили в 96-луночных планшетах с использованием метода определения термического высвобождения частиц (PaSTRy) на системе для ПЦР в реальном времени CFX96. Для детектирования РНК-генома, обнажающегося после диссоциации вирусной оболочки под воздействием повышенной температуры, использовался краситель SYBR Green II, связывающийся с РНК. Конкретная процедура следующая: 1 мкг очищенного вируса ящура смешивали с 5 мкл 100× раствора красителя SYBR Green II и доводили общий объем до 50 мкл с помощью 1× PBS. В экспериментах по изучению роли кальция дополнительно добавляли 300 мМ хлорида кальция, разбавляя его до конечных концентраций 3, 10, 30 и 50 мМ. Температуру измерения повышают от 15 °C с шагом 0,5 °C до 95 °C с интервалом 10 секунд между каждым повышением; длину волны возбуждения и длину волны излучения устанавливают соответственно на 490 нм и 516 нм, после чего считывают значения флуоресценции.
2.6 Приготовление вакцины против ящура. Для получения антигена вакцины против ящура к очищенному вирусу ящура штамма «Цзиньчуань» типа O добавляют два компонента на основе буфера Tris-KCl: (i) 3 мМ хлорида кальция; (ii) смесь 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сывороточного белка (SLA). Вакцинный антиген смешивают с 1 %-ным гелем сапонина и 10 %-ным гелем гидроксида алюминия, а затем в соотношении 1:1 добавляют адъювант ISA 206 VG для получения экспериментальной вакцины в дозах по 2 мл. После смешивания смесь инкубируют в водяной бане при 20 °C в защищённом от света месте в течение 1 часа, а затем хранят при 4 °C до использования.
2.7 Иммунизация свиней Эффективность вакцины против ящура определяется вирусными частицами, называемыми 146S. Известно, что в случае распада цельных частиц 146S вируса ящура на пятимеры 12S эффективность вакцины значительно снижается. Поэтому нет необходимости оценивать иммуногенность образцов, содержащих 12S и не содержащих 12S, полученных в ходе эксперимента по хранению при 4 °C, на свиньях. Целью данного исследования было оценить, влияет ли добавление кальция (который, как было подтверждено, повышает стабильность вируса штамма Jinchuan типа O) на его иммуногенность в организме свиней. Кроме того, поскольку экспериментальная вакцина была приготовлена путем очистки и количественного определения только частиц 146S и вводилась свиньям в дозе 15 мкг на одну дозу, она не содержала деградированных форм 12S. Были отобраны 18 свиней 8-недельного возраста, у которых с помощью ELISA был подтвержден отрицательный результат на антитела к структурным белкам (SP); им внутримышечно вводили вакцину против ящура, содержащую хлорид кальция (n = 6) или SLA (n = 6). Все свиньи получили две дозы вакцины, каждая из которых составляла 2 мл и содержала 15 мкг антигена 146S; с момента первой вакцинации и в течение 56 дней еженедельно отбирались образцы крови.
2.8 Иммуноферментный анализ (ELISA) Для измерения уровня антител, индуцированных вакциной против ящура, использовался набор для определения антител к вирусу ящура типа O «PrioCHECK», и проводился конкурентный иммуноферментный анализ (ELISA) в соответствии с инструкциями производителя.
2.9 Тест на нейтрализацию вируса. Процедура проведения теста на нейтрализацию вируса ящура для выявления антител к вирусу ящура соответствует руководящим принципам, изложенным в «Руководстве по наземным животным» Всемирной организации здравоохранения животных (WOAH).
2.10 Статистический анализ. Для визуального анализа статистических данных используется программа GraphPad Prism версии 9. Статистическая значимость определяется с помощью непарного t-критерия.
3 Результаты 3.1 Оценка термостабильности вируса ящура Для определения термостабильности вируса ящура мы использовали метод определения термического высвобождения частиц (PaSTRy), в котором для обнаружения обнажения вирусного генома применялся краситель, встраивающийся в нуклеиновые кислоты. Основной принцип этого метода заключается в воздействии на очищенные вирусные частицы температурного градиента от комнатной температуры до высокой температуры: по мере повышения температуры вирусные частицы претерпевают структурные изменения и диссоциируют, в результате чего высвобождается вирусный геном. Восемь штаммов вируса ящура различных серотипов (типы O и A) были очищены центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (SDG) и подвергнуты анализу методом PaSTRy. Результаты показали, что даже в пределах одного серотипа значения температуры плавления (Tm) у разных штаммов вируса значительно различаются, что свидетельствует об их различной термостабильности. Примечательно, что стабильность вируса O-типа ниже, чем у вируса A-типа. Среди всех исследованных штаммов вируса ящура наибольшую стабильность продемонстрировал изолированный в Китае штамм A-типа «Ляньчуань», у которого значение Tm составило 54 °C; в то же время штамм O-типа «Цзиньчуань» проявил явную нестабильность, и его значение Tm составило всего 43 °C (рис. 1).
Рис. 1. Анализ термостабильности антигена вакцины против ящура. Для детектирования вирусного РНК-генома, высвобождаемого из капсида, использовался краситель SYBR Green II. На графике представлено соотношение первой производной флуоресценции и повышения температуры в диапазоне от 15 до 95 °C. Одиночный пик плавления свидетельствует о высвобождении РНК, а соответствующая температура является температурой плавления (Tm).
3.2 Влияние обработки кальцием на улучшение термостабильности вируса ящура В данном исследовании оценивалось влияние добавления хлорида кальция в качестве стабилизатора на термостабильность вируса ящура. Очищенный вирус ящура обрабатывали хлоридом кальция различной концентрации, а влияние этой обработки на термостабильность анализировали с помощью метода PaSTRy. Результаты показали, что после обработки кальцием термостабильность всех штаммов вируса ящура улучшилась, причем эффект стабилизации частиц 146S увеличивался в зависимости от дозы (табл. 1). Однако при концентрации хлорида кальция свыше 30 мМ стабильность частиц 146S демонстрировала тенденцию к постепенному снижению, а при концентрации 50 мМ стабильность вируса значительно снизилась по сравнению с необработанной контрольной группой. Среди всех исследованных штаммов вируса ящура наилучший эффект стабилизации достигался при концентрации кальция 10 мМ.
Таблица 1. Термостабильность вируса ящура при различных концентрациях кальция по данным PaSTRy
Примечание: температура ≥50 °C считается стабильной; изменение цвета с зелёного на жёлтый свидетельствует о снижении стабильности капсида вируса ящура (146S). Символ «-» означает отсутствие данных.
3.3 Оценка стабильности вируса ящура при длительном хранении
В данном исследовании оценивалось потенциальное стабилизирующее действие хлорида кальция на длительное хранение антигена вакцины против ящура, при этом в качестве положительного контроля использовался мощный стабилизатор SLA. Очищенный вирус ящура штамма O-Jinchuan добавляли в 10 мМ раствор хлорида кальция и хранили при 4 °C в течение 6 месяцев (рис. 2). Коэффициент извлечения антигена 146S измеряли через 1, 3 и 6 месяцев. Результаты показали, что в группе без обработки (NC) коэффициент извлечения 146S постепенно снижался с течением времени: в частности, через 1 месяц он составлял 80 %, через 3 месяца снизился до 68 %, а через 6 месяцев — до 45 %. Напротив, в группе, подвергнутой обработке кальцием, целостность антигена 146S сохранялась на протяжении всего периода хранения, и заметной потери антигена не наблюдалось. Кроме того, стабилизирующий эффект хлорида кальция был значительно выше, чем в группе без обработки (p = 0,0001), и сопоставим с эффектом мощного стабилизатора SLA.
Рис. 2. Влияние вспомогательных веществ на хранение вируса ящура в холодовой цепи. Антиген 146S вируса ящура штамма «Цзиньчуань» типа O в виде неформулированного препарата, препарата с добавлением SLA и препарата с добавлением кальция хранили при температуре 4 °C в течение 6 месяцев. Содержание частиц 146S измеряли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, а коэффициент извлечения выражали в процентах (%). **** обозначает p < 0,0001; ns обозначает отсутствие значимых различий. Сокращения: NC — отрицательный контроль (без вспомогательных веществ); SLA — смесь 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сывороточного белка; Ca — 10 мМ хлорида кальция.
3.4 Иммуногенность вакцины против ящура с добавлением стабилизаторов в организме свиней В данном исследовании оценивалась иммуногенность вакцины против ящура с добавлением стабилизаторов (хлорида кальция и SLA). Свиней 8-недельного возраста разделили на 3 группы по 6 голов в каждой (1-я группа: без стабилизаторов; 2-я группа: с SLA; 3-я группа: с хлоридом кальция). Иммунизация проводилась двукратно путем внутримышечной инъекции с интервалом в 4 недели; образцы крови отбирали еженедельно в течение 56 дней после первой вакцинации (рис. 3а). Результаты показали, что во всех группах уровни антител к структурному белку (SP) и вирусонейтрализующих (VN) антител продолжали повышаться в течение 56 дней. Что касается антител к структурному белку (SP), у всех свиней, начиная с 35-го дня, были подтверждены положительные значения коэффициента ингибирования (PI) (≥50 %), при этом значимых различий между группами не наблюдалось (штамм O-типа Цзиньчуань против группы SLA, p = 0,4749; штамм O-типа Цзиньчуань против группы с обработкой кальцием, p = 0,3075; группа SLA против группы с обработкой кальцием, p = 0,0935) (рис. 3b). Через 21 день титр вирусонейтрализующих (VN) антител у всех свиней против гомологичного вируса (O/Jinchuan/SKR/2014) превышал 1:45, а после ревакцинации составлял около 1:1000. Титр в группе с хлоридом кальция был сопоставим с другими группами (штамм O-типа Jinchuan по сравнению с группой SLA, p = 0,6672; штамм O-типа Цзиньчуань против группы с обработкой хлоридом кальция, p = 0,8816; группа SLA против группы с обработкой хлоридом кальция, p = 0,7779) (рис. 3c). Это свидетельствует о том, что хлорид кальция не оказывает негативного влияния на иммуногенность антигена 146S вакцины против ящура в организме свиней.
Рис. 3. Иммуногенность вакцины против ящура, содержащей стабилизирующие вспомогательные вещества. Вакцина против ящура типа O (штамм Jinchuan), приготовленная с добавлением SLA (смесь 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сывороточного белка) и кальция (10 мМ), индуцировала выработку антител. (a) План эксперимента: 8-недельных поросят разделили на 3 группы по 6 голов в каждой: группа без стабилизатора, группа SLA и группа с добавлением кальция. Им проводили две вакцинации на 0-й и 28-й дни, а образцы крови отбирали еженедельно до 56-го дня. (b) С помощью иммуноферментного анализа (ELISA) определяли титр антител к структурному белку (SP); значение титра выражалось в виде коэффициента ингибирования (PI), причем значение PI ≥ 50 % (пунктирная линия) считалось положительным результатом. (c) С помощью вирусного нейтрализационного теста определяли титр антител к гомологичному вирусу (VN); титр ≥ 1:45 (пунктирная линия) считался положительным результатом.
4. Обсуждение. В период с ноября 2010 г. по апрель 2011 г. в Южной Корее произошла крупномасштабная вспышка ящура, которая привела к экономическому ущербу в размере около 3 трлн вон. После этого в Южной Корее была введена политика вакцинации крупного рогатого скота, свиней и коз на всей территории страны. Все три вида вакцин против ящура, используемые в настоящее время, импортируются из-за рубежа, поэтому Южная Корея планирует построить собственные производственные мощности по выпуску вакцин против ящура и уже разработала исходный вирус для производства вакцин. При оценке исходного вируса мы обнаружили, что вирус штамма Чинчхон типа O обладает физической нестабильностью. Для решения этой проблемы мы ранее разработали стабилизатор на основе SLA. Однако SLA обладает вязкостью, что затрудняет его смешивание с вспомогательными веществами вакцины, а также создает риск микробиологического загрязнения. Целью данного исследования был поиск простого заменителя SLA в качестве стабилизатора вакцины, и было обнаружено, что кальций способен повысить стабильность физически нестабильного вируса штамма Чинчхон типа O.
При производстве многих вирусных вакцин содержание антигена иногда рассчитывается на основе количества субъединичных белков; однако в случае вакцины против ящура, поскольку распад частиц 146S на пентамеры (12S) значительно снижает иммуногенность вакцины, необходимо измерять содержание цельных вирусных частиц (146S), а не содержание субъединичных белков. Таким образом, содержание антигена в вакцине против ящура можно измерить путем очистки вирусных частиц с помощью ультрацентрифугирования или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием гелевых колонок, способных разделять вещества по размеру частиц. В конечном итоге, количество извлеченных частиц 146S является ключевым фактором в производстве вакцины против ящура. Поэтому разработка стабилизаторов для преодоления нестабильности антигена имеет решающее значение, поскольку вирус ящура может разрушаться в процессе производства вакцинного антигена, что снижает его ценность в качестве вакцинного антигена.
Предыдущие исследования термостабильности серотипов вируса ящура показали, что наименьшую термостабильность демонстрирует серотип SAT, за которым следуют серотипы O, C, Asia1 и A. Поэтому многие исследователи проводили работы по повышению стабильности вируса ящура, уделяя основное внимание серотипу SAT, а метод PaSTRy широко использовался для оценки стабильности вируса ящура. В данном исследовании метод PaSTRy был применен к самостоятельно разработанным вирусам ящура серотипов O и A. Было обнаружено, что вирус серотипа O штамма «Цзиньчуань» имеет самое низкое значение Tm, что свидетельствует о его высокой нестабильности. В предыдущих исследованиях сообщалось, что по сравнению с другими вирусами ящура вирус серотипа O штамма «Цзиньчуань» более подвержен деградации при 45 °C, и метод PaSTRy, примененный в данном исследовании, вновь подтвердил нестабильность вируса серотипа O штамма «Цзиньчуань».
Ионы двухвалентных переходных металлов оказывают стабилизирующее действие путем образования солевых мостиков на границах между пентамирами оболочки вируса ящура, причем это действие зависит от штамма вируса. Мы проверили стабильность штаммов, выделенных в Китае, путем обработки их кальцием, никелем и медью и обнаружили, что никель и медь не оказывают никакого эффекта, тогда как кальций способствует повышению стабильности штаммов типов O и A. Результаты измерений методом PaSTRy показали, что при концентрации кальция 10 мМ значение Tm демонстрирует тенденцию к повышению, а при концентрации кальция свыше 30 мМ — к снижению, что согласуется с ранее опубликованными данными, согласно которым значение Tm после обработки 500 мМ кальция было ниже, чем у необработанной контрольной группы. Результаты нашего исследования указывают на то, что высокая концентрация ионов кальция может снижать стабильность вируса ящура. Кроме того, другие исследователи сообщали о стабилизирующем эффекте кальция, схожем с результатами нашего исследования: максимальное значение Tm наблюдалось при совместном использовании 10 мМ кальция и 0,2–0,4 М NaCl.
Поскольку вакцины против ящура обычно хранятся в условиях холодильного хранения, оценка их стабильности в таких условиях имеет важное значение. Целью данного исследования была оценка стабилизирующего эффекта хлорида кальция на нестабильный штамм вируса ящура типа O «Цзиньчуань». Как и ожидалось, количество антигена в необработанной вакцине со временем значительно уменьшалось; напротив, после добавления кальция стабильность вакцины при хранении повысилась и стала сопоставимой со стабилизатором SLA, использовавшимся ранее. В одном из предыдущих исследований, посвящённом оценке стабильности вируса ящура при различных температурах, количество антигена в вирусе ящура, выделенном в Китае, практически не изменилось при 4 °C, тогда как при 37 °C за 6 часов оно уменьшилось примерно на 90 %; у вируса ящура, выделенного в Аргентине, содержание антигена уменьшилось примерно на 90 % в течение 24 часов при 37 °C. Хотя многие вирусы ящура демонстрируют термическую нестабильность при 37 °C, то, что штамм O-типа «Цзиньчуань», исследуемый в данном исследовании, проявил столь высокую нестабильность даже при 4 °C, является довольно редким явлением. В наших предыдущих исследованиях сообщалось, что вирус типа O штамма «Цзиньчуань» обладает нестабильностью, причем его стабильность значительно варьируется в зависимости от типа буферного раствора, что указывает на присущую этому вирусу низкую стабильность. Несмотря на то, что было подтверждено, что хлорид кальция способен повышать стабильность вируса типа O штамма «Цзиньчуань», для окончательной оценки его применимости в качестве вакцины необходимо изучить иммуногенность антигена с добавлением хлорида кальция на целевых животных.
Эффективность вакцины против ящура определяется вирусными частицами, называемыми 146S. Известно, что если цельные частицы 146S вируса ящура распадаются на пятимеры 12S, эффективность вакцины значительно снижается. Поэтому нет необходимости оценивать иммуногенность образцов, содержащих 12S, и образцов, не содержащих 12S, на свиньях (рис. 2). Целью данного исследования было оценить, влияет ли добавление кальция (который, как было подтверждено, повышает стабильность вируса штамма Jinchuan типа O) на его иммуногенность в организме свиней. Кроме того, поскольку экспериментальная вакцина была приготовлена путем исключительно очистки и количественного определения частиц 146S, она не содержала деградированной формы 12S. Титр антител был сопоставим с контрольным антигеном, что подтвердило потенциал данной вакцины в качестве средства против ящура. Кроме того, после ревакцинации титр вирусной нейтрализации (VN) достиг примерно 1:1000, что, исходя из корреляции между титром вирусной нейтрализации (VN) и защитным эффектом in vivo, свидетельствует о том, что данная вакцина, по-видимому, обеспечивает защиту от вируса ящура.
Сообщалось о различных стратегиях повышения стабильности вируса ящура, включая замену аминокислотных остатков, участвующих в электростатическом отталкивании, или усиление взаимодействия между пентамирами. Однако по сравнению с созданием вариантов вируса ящура SLA представляет собой более простой метод повышения стабильности вируса ящура, а хлорид кальция, как новый стабилизатор, оказался способным преодолеть трудности, связанные с использованием SLA в процессе обработки. Как показано в данном исследовании, иммуногенность в группах SLA и хлорида кальция в организме свиней была сопоставимой. Таким образом, по сравнению с SLA хлорид кальция легче смешивать и хранить с различными вакцинными наполнителями; в качестве стабилизатора вакцины он может широко применяться не только в вакцинах против ящура, но и в других ветеринарных вакцинах.
5. Выводы. Вирус ящура штамма «Цзиньчуань» типа O из-за склонности к диссоциации в процессе хранения трудно использовать в качестве вакцины против ящура; однако после обработки вируса ящура штамма «Цзиньчуань» типа O хлоридом кальция он может стать кандидатом в вакцины. Эти результаты исследований, как ожидается, будут способствовать разработке стабильных вакцинных препаратов, что особенно актуально для штаммов вируса ящура, отличающихся низкой собственной стабильностью.
