2026-09-02
Резюме
Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) вызывает у свиней острое, высокозаразное кишечное заболевание, приводящее к серьезным экономическим потерям, особенно из-за высокой смертности среди подсосных поросят. В настоящее время специфических противовирусных препаратов не существует. В данном исследовании мы оценили потенциал лейгонтонового красного пигмента (натурального тритерпенового соединения, полученного из растения Lonicera japonica) в качестве средства против PEDV на клетках Vero E6. Мы обнаружили, что лейгонтонерин в дозозависимой манере значительно ингибирует репликацию PEDV, воздействуя преимущественно на поздние стадии жизненного цикла вируса. Анализ сетевой фармакологии выявил, что ключевым сигнальным путем является апоптоз, а исследование механизмов показало, что лейгонтонерин усиливает индуцированное PEDV накопление активных форм кислорода (ROS), что, в свою очередь, запускает апоптоз и ингибирует синтез вирусной РНК, экспрессию белков и образование дочерних вирусных частиц. Важно отметить, что ингибирование ROS устраняет противовирусную активность лейгонтонового красного, что подтверждает ROS-зависимый механизм действия. Кроме того, лейгонтоновый красный продемонстрировал ингибирующее действие in vitro в отношении свиного коронавируса типа D (PDCoV) и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Эти результаты указывают на то, что лейгонтоновый красный является потенциальным кандидатом в лекарственные средства для профилактики и борьбы с PED и другими вирусными инфекциями свиней.
Ключевые слова: противовирусные препараты; апоптоз; лейкотонол; сетевая фармакология; вирус эпидемической диареи свиней
1. Введение. Эпидемический диарейный синдром свиней (PED) — это высокозаразное острое кишечное заболевание, поражающее свиней всех возрастов, причем особенно тяжело оно протекает у подсосных поросят. Заболевание вызывается вирусом PED (PEDV) и характеризуется сильной диареей, рвотой и обезвоживанием; при серьезных вспышках летальность среди подсосных поросят достигает почти 100 %. Вирус PEDV был впервые обнаружен в 1971 году в Великобритании и относится к роду коронавирусов типа А семейства коронавирусов. Он обладает линейным одноцепочечным РНК-геномом с положительной полярностью, в котором гены расположены в следующем порядке: 5′-UTR, полипротеин 1a/b реплиазы (ORF1a/b), спайковый белок (S), ORF3, белок оболочки (E), мембранный белок (M), нуклеокапсидный белок (N) и 3′-UTR. Одной из ключевых проблем при разработке вакцин против PED является то, что иммунный давление, вызванное вакцинацией, может индуцировать мутации в гене S, позволяющие вирусу ускользать от иммунной системы. Недавние исследования показывают, что из-за таких генетических мутаций коммерческие вакцины не могут обеспечить достаточную защиту от циркулирующих штаммов. Эти проблемы подчеркивают острую необходимость поиска противовирусных препаратов в качестве эффективной и комплексной альтернативной стратегии борьбы с заболеванием.
В последние годы соединения растительного происхождения привлекают всё большее внимание благодаря своему терапевтическому потенциалу, особенно в борьбе с вирусными инфекциями, такими как PEDV. Примечательно, что многие современные лекарственные препараты были разработаны на основе биологически активных растительных соединений. Поиск противовирусных препаратов растительного происхождения начался ещё в 1950-х годах, когда учёные оценили эффективность более 200 видов растений в отношении вируса гриппа А на куриных эмбрионах. Недавно активность против PEDV продемонстрировали такие соединения, как кверцетин, дибензилизохинолиновые алкалоиды, глицирризиновая кислота, гриффицин и левистолид А. Несмотря на эти достижения, в настоящее время коммерчески доступных препаратов против PEDV не существует, что подчеркивает необходимость дальнейшего изучения природных продуктов в качестве потенциальных противовирусных средств.
Лейгонтонол, также известный как наншетонол, представляет собой природное пятичленное тритерпеновое соединение, извлекаемое из растения Лейгонто (Leigongteng), используемого в традиционной китайской медицине. Обширные фармакологические исследования показывают, что лейгонтонол обладает разнообразной терапевтической активностью, включая иммуномодулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое, противофиброзное и противовирусное действие, а также защитное действие на сердечно-сосудистую, цереброваскулярную и нервную системы. Лейгонтонг-рубифлин проявляет противовирусную активность в отношении множества вирусов посредством различных механизмов. Например, лейгонтонг-рубифлин снижает репликацию α-герпесвируса лошади типа 8 путем активации пути Nrf2/HO-1, подавляет репликацию вируса денге путем индукции экспрессии IFN-α и активации сигнального пути JAK-STAT, а также ингибирует вирус гриппа типа А, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека и человеческий паромивирус. Примечательно, что лейгонтонеин демонстрирует мощную противовирусную активность в отношении β-коронавируса SARS-CoV-2 посредством связывания с вирусным белком S, ингибирования активности 3CL Pro, снижения вирусной репликации, уменьшения секреции IL-6, а также смягчения легочных поражений у пациентов с тяжелым течением COVID-19. Эти результаты свидетельствуют о том, что лейгонтонеин является перспективным противовирусным препаратом, обладающим потенциалом для применения в отношении различных вирусов, включая коронавирус типа А PEDV. В данном исследовании мы изучили его противовирусную активность в отношении PEDV и выяснили потенциальные механизмы действия.
В данном исследовании мы изучили противовирусную активность лейкотонолбиола в отношении PEDV на клетках Vero E6. Проведя сетевой фармакологический анализ взаимодействий лейкотонолбиола с ключевыми белками вируса, мы сосредоточили внимание на путях апоптоза и выявили, что индуцированный лейкотонолбиолом апоптоз, опосредованный активными формами кислорода (ROS), является ключевым механизмом его противовирусного действия в отношении PEDV. Кроме того, мы подтвердили in vitro противовирусную активность лейгонтонового красного пигмента в отношении двух других важных свиных вирусов — свиного коронавируса типа D (PDCoV) и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Эти результаты свидетельствуют о том, что лейгонтоновый красный пигмент имеет значительные перспективы в свиноводстве в качестве препарата для лечения инфекций, вызванных PEDV.
2. Материалы и методы 2.1 Культивирование клеток и вирус. Эпителиальные клетки почек африканской зелёной мартышки (Vero E6; ATCC CRL-1586), клетки свиной почки 15 (PK-15; ATCC CCL-33) и эпителиальные клетки эмбриональной почки мартышки (Marc-145; ATCC CRL-12231) культивировали в среде Дульбекко, модифицированной Игл (DMEM; GIBCO), с добавлением 10 % сыворотки плода быка (FBS; EvaCell). Штамм PEDV CV777 (GenBank: KT323979.1) культивировали и титровали в клетках Vero E6, штамм PDCoV HKU15 (GenBank: NC_039208.1) — в клетках PK-15, а штамм PRRSV BJ4 (GenBank: AF331831.1) — в клетках Marc-145.
2.2 Антитела и реагенты Мышиные моноклональные антитела к N-белку PEDV, N-белку PDCoV и N-белку PRRSV хранятся в нашей лаборатории. Мышиное моноклональное антитело к GAPDH (арт. № AF0006), мышиное моноклональное антитело к α-тубулину (арт. № AF2827), мышиное моноклональное антитело к β-актинину (арт. № AF0003), козье антитело к мышиному IgG, меченное HRP (арт. № A0216), и козье антитело к кроличьему IgG, меченное HRP (арт. № A0208) были приобретены у компании Beyotime Biotechnology. Мышиное моноклональное антитело к Bcl-2 (124) (арт. № 15071), кроличье моноклональное антитело к каспазе-3 (D3R6Y) (арт. № 14220) и кроличье моноклональное антитело к расщеплённой каспазе-3 (Asp175) (арт. № 9664) были приобретены у компании Cell Signaling Technology. Козье антитело против мышиных антител, конъюгированное с Alexa Fluor 488 (арт. № HS231-01), было приобретено у компании TransGen Biotech. Козье антитело против кроличьих антител, конъюгированное с Alexa Fluor 594 (арт. № A-11012), было приобретено у компании Thermo Fisher Scientific.
2.3 Оценка цитотоксичности. Цитотоксичность регонгтонового красного оценивали с помощью метода MTT. Вкратце, клетки Vero E6, PK-15 и Marc-145, посеянные в 96-луночную плашку, обрабатывали лейкотоновым красным (TargetMol, арт. № T3028) в возрастающих концентрациях (от 0,25 до 2 мкМ) в течение 24 часов при 37 °C и 5 % CO₂. Затем удаляли культуральную среду и добавляли 100 мкл MTT (3-[4,5-диметил-2-тиазолил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, 0,5 мг/мл), после чего инкубировали при 37 °C в течение 4 часов. После удаления супернатанта в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO для растворения кристаллов метиофена в течение 10 минут. С помощью микропланшетного считывателя измеряли оптическую плотность (OD) при длине волны 490 нм. Концентрацию, вызывающую 50 % цитотоксичности (CC50), рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния).
2.4 Метод непрямой иммунофлюоресценции (IFA). Клетки промывают PBS, а затем фиксируют 4 %-ным раствором полиформальдегида (PFA) в течение 20 минут. Затем в каждую лунку добавляют 0,25 % (об./об.) Triton X-100 и инкубируют при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут для пермеабилизации клеточных мембран. После трёхкратного промывания PBS клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в PBS, содержащем 5 % бычьего сывороточного альбумина (BSA). Добавляли моноклональные антитела мыши против PEDV N, разведённые в соотношении 1:500, и инкубировали при 4 °C в течение ночи, после чего добавляли козьи антитела против мышиных антител, конъюгированные с Alexa Fluor 488, разведённые в соотношении 1:1000, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Ядра клеток окрашивают 4′,6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI). Изображения получают с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CKX53.
2.5. Протеиновый блоттинг. Клетки лизируют при 4 °C в RIPA-буфере для лизиса, содержащем 1 мМ бензоилсульфонилфтора (PMSF). Супернатант центрифугировали при 10 000 g в течение 20 минут при 4 °C. Равные объемы клеточного лизата наносили на гель с додецилсульфатом натрия и полиакриламидом (SDS-PAGE), а затем переносили на PVDF-мембрану. Мембрану блокировали 5 %-ным раствором обезжиренного сухого молока при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем добавляли мышиное моноклональное антитело против PEDV N, разбавленное в соотношении 1:500, инкубировали при 4 °C в течение ночи, после чего добавляли козье антитело против мышиного IgG, меченное HRP, разбавленное в соотношении 1:1000, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
2.6 Количественная обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) РНК из образцов выделяли с помощью набора для быстрого выделения тотальной РНК (Fastagen, Шанхай, Китай), а затем проводили обратную транскрипцию в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием набора PrimeScript RT с gDNA Eraser (Takara Bio). Для определения экспрессии генов в образцах кДНК использовали ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности праймеров, использованных для RT-qPCR, приведены в таблице 1. Количественную ПЦР в реальном времени проводили на системе CFX96 (Bio-Rad). Относительная экспрессия РНК каждого целевого гена нормализовывалась по GAPDH в качестве внутреннего контроля, а затем рассчитывалась с помощью метода 2-ΔΔCT. Таблица 1. Последовательности праймеров для RT-qPCR
2.7 Определение TCID50. Титр всех вирусных образцов в данном исследовании определялся методом TCID50. В частности, клетки Vero E6 высевали в 96-луночные планшеты и культивировали при 37 °C. После удаления супернатанта клетки инфицировали 10-кратным последовательным разведением образца (исследуемая группа) или средой DMEM (группа слепого контроля) на 4 дня, после чего наблюдали за эффектом клеточной лезии. В тестовой группе и группе пустого контроля было по 8 повторных лунок; TCID50 рассчитывали по методу Рида и Мюнча.
2.8 Определение противовирусной активности. Определение противовирусной активности проводилось с целью оценки способности ингибировать PEDV in vitro. Однослойные культуры клеток Vero E6, выращенные в 24-луночной планшете, предварительно обрабатывали лейкотоновым красным в различных концентрациях в течение 4 часов, после чего инфицировали PEDV (мультипликатор инфекции [MOI] = 0,1) при 37 °C в течение 1 часа. Удаляли супернатант и добавляли свежую культуральную среду, содержащую различные концентрации лейкотонового красного. Затем через 24 часа после инфицирования (hpi) собирали клетки и супернатант и определяли противовирусную активность с помощью RT-qPCR, вестблутинга, TCID50 и IFA.
2.9 Определение длительной противовирусной активности Монослой клеток Vero E6, культивируемых в 24-луночных планшетах, предварительно обрабатывали регонтоном в различных концентрациях в течение 4 часов, а затем инфицировали PEDV с MOI = 0,1 при 37 °C в течение 1 часа. Сверхжидкость удаляли и добавляли свежую культуральную среду, содержащую лейкотонинол в различных концентрациях. Затем через 12, 24 и 36 ч после инфицирования (hpi) собирали клетки и супернатант и определяли противовирусную активность с помощью RT-qPCR, вестблутинга и TCID50 соответственно.
2.10 Определение активности против PDCoV и PRRSV В эксперименте по определению активности лейкотонинола против PDCoV монослой клеток PK-15, культивируемых в 24-луночных планшетах, предварительно обрабатывали лейкотонинолом в различных концентрациях в течение 4 часов, а затем инфицировали PDCoV с MOI = 0,1 при 37 °C в течение 1 часа. Удаляли супернатант и добавляли свежую культуральную среду, содержащую лейкотонинол. Затем через 24 ч после инфицирования (hpi) собирали клетки и супернатант и определяли противовирусную активность с помощью RT-qPCR и вест-блоттинга.
Для эксперимента по определению противовирусной активности лейкотонофлорина против PRRSV монослой клеток Marc-145, культивируемых в 24-луночной планшете, предварительно обрабатывали лейкотонофлорином в различных концентрациях в течение 4 часов, а затем инфицировали PRRSV с MOI = 0,1 при 37 °C в течение 1 часа. Сверхжидкость удаляли и добавляли свежую культуральную среду, содержащую различные концентрации регонгтонг-рубинола. Затем через 24 часа после заражения (hpi) собирали клетки и супернатант, после чего определяли противовирусную активность с помощью RT-qPCR и вестблутинга.
2.11 Определение с учетом времени: 10⁵ клеток Vero E6 высевали в 24-луночный планшет, после чего инфицировали вирусом PEDV с MOI 0,1 в течение 1 часа (при 37 °C). В ходе инфицирования вирусом PEDV препараты вводили в виде предварительной обработки (preincubation), одновременной обработки (during-time), последующей обработки (post-time) или обработки на протяжении всего периода (full-time). В группе предварительной обработки клетки инкубировали с 0,5 мкМ регонгтонином при 37 °C в течение 4 часов, затем трижды промывали PBS и инфицировали PEDV с MOI = 0,1 в течение 1 часа (37 °C). В группе одновременной обработки клетки инкубировали одновременно с PEDV и 0,5 мкМ регонгтонином в течение 1 часа (37 °C). Затем удаляли смесь вируса и препарата, трижды промывали клетки PBS, после чего добавляли полную культуральную среду. В группе с последующей обработкой клетки сначала инфицировали PEDV в течение 1 часа (при 37 °C). Затем удаляли вирус, трижды промывали клетки PBS, после чего добавляли полную культуральную среду, содержащую 0,5 мкМ регонгтонового красного. Для группы с полным циклом обработки клетки сначала инкубировали с 0,5 мкМ регонгтоновым красным в течение 4 часов. Затем раствор удаляли, и клетки трижды промывали PBS. После этого клетки одновременно подвергали воздействию PEDV и 0,5 мкМ регонгтонового красного и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа. После этого удаляли вирус, трижды промывали клетки PBS, а затем обрабатывали полной культуральной средой, содержащей 0,5 мкМ регонгтонового красного. Через 24 часа после заражения (hpi) собирали образцы, определяли титр вируса методом конечного разведения и измеряли уровень мРНК гена N PEDV с помощью RT-qPCR.
2.12 Определение вирусоцидного действия: PEDV (1 MOI) смешивали с 1 мкМ регонгтоновым красным или равным объёмом DMSO и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа. Чтобы исключить потенциальное влияние регонгтонового красного на инфекцию PEDV, смесь разбавляли в 100 раз и немедленно добавляли к клеткам Vero E6. Через 72 часа собирали вирус и определяли титр методом TCID₅₀.
2.13 Сетевая фармакология. Из баз данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php), SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) и CTD (https://ctdbase.org/) были получены 379 мишеней регонгтонового красного. Кроме того, с использованием ключевого слова «virus» и после отбора по критерию «Relevance» с оценкой выше 2 из базы данных GeneCards было получено 3830 мишеней, связанных с заболеваниями. С помощью диаграммы Венна было построено пересечение мишеней лейкотонового красного и вирусов.
2.14 Метод молекулярного докинга: MAPK1 (PDB ID: 4QTA), MAPK3 (PDB ID: 3FHR), IL6 (PDB ID: 1ALU), CASP3 (PDB ID: 1GFW), AKT1 (PDB ID: 4QTA), IL1B (PDB ID: 1HIB), MAPK8 (PDB ID: 2XRW), NFKB1 (PDB ID: 1LE5), TP53 (PDB ID: 4MZR) и MAPK14 (PDB ID: 2FST) были загружены из базы данных PDB (https://www.rcsb.org/). Молекулярная структура лейкотонол (PubChem CID: 122724) была загружена из базы данных PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Для подготовки белковых структур к докингу использовалось программное обеспечение PyMOL, с помощью которого были удалены все лишние органические остатки и молекулы воды. С помощью программы AutoDock для каждой мишени была сгенерирована сетка докинга. Путем сравнения моделей связывания исходных лигандов были заданы полугибкие параметры докинга для определения конформации комплекса лейкотонол с наиболее благоприятной энергией свободы связывания. Результаты докинга были визуализированы в трехмерном виде с помощью программы PyMOL, что позволило наглядно продемонстрировать взаимодействие лейкотонола с его целевыми белками.
2.15 Определение уровня ROS в клетках Для определения ROS использовался набор для детектирования ROS DCFH-DA (Solarbio, Пекин, Китай). Вкратце, клетки Vero E6, посеянные в 12-луночную плашку, инфицировали PEDV (MOI = 0,1) в течение 1 часа при 37 °C и 5 % CO₂, после чего сбрасывали супернатант и обрабатывали репутоновым красным в течение 24 часов или не обрабатывали. Клетки Vero E6 трижды промывали PBS, а затем окрашивали 10 мкМ DCFH-DA (растворенного в DMEM) в течение 45 минут. В качестве положительного контроля использовали Rosup (50 мг/мл). Определение АФК проводили в канале FITC. Клетки с положительным окрашиванием анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
2.16 Статистический анализ Все данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния) и представляли в виде средних значений ± стандартной ошибки, полученных по результатам не менее трёх независимых экспериментов. Для статистического сравнения между группами использовался t-критерий Стьюдента (для сравнения средних значений двух независимых или парных групп), а для анализа влияния двух классификационных независимых переменных и их взаимодействия на непрерывную зависимую переменную — двухфакторный дисперсионный анализ (two-way ANOVA). Использовались двусторонние p-значения.
3. Результаты 3.1 Лейгонтонин подавляет инфекцию PEDV в зависимости от дозы. Химическая структура лейгонтонина представлена на рисунке 1A. Тестирование цитотоксичности в клетках Vero E6 с использованием метода MTT показало, что концентрация, вызывающая 50 % гибели клеток (CC50), составляет 1,583 мкМ (рис. 1B). Антивирусная активность лейгонтонового красного цвета в отношении PEDV оценивалась с помощью вест-блоттинга, RT-qPCR, TCID50 и IFA. Как показано на рис. 1C и 1D, лейгонтоновый красный цвет дозозависимо значительно подавлял экспрессию N-белка PEDV и уровень мРНК N-белка PEDV; через 24 ч после заражения (hpi) значительное подавление наблюдалось при концентрациях 0,1–0,5 мкМ. Соответственно, регонгтонг-рубифлин значительно снижал титр PEDV, определенный методом конечного разведения на основе эффекта клеточных поражений (рис. 1E). ИФА дополнительно подтвердила дозозависимое снижение доли инфицированных клеток (рис. 1F). Эти результаты свидетельствуют о том, что регонгтонг-рубифлин эффективно ингибирует репликацию PEDV в клетках Vero E6, демонстрируя при этом крайне низкую цитотоксичность.
Flg 1. Цитотоксичность репурофлина в клетках Vero E6 и его активность против вируса эпидемической диареи свиней (PEDV). (A) Химическая структура лейгонгтонового антоциана. (B) Определение цитотоксичности лейгонгтонового антоциана в клетках Vero E6 через 24 часа после инфицирования (24 hpi) с помощью метода MTT и расчет концентрации, вызывающей 50 % ингибирование (значение CC50), с помощью программы GraphPad Prism 8.0. (C) Легонгтонг-рубинол ингибирует экспрессию N-белка PEDV в клетках Vero E6. (D) Легонгтонг-рубинол ингибирует транскрипцию гена N PEDV. (E) Легонгтонг-рубинол снижает титр PEDV, определённый методом TCID50. (F) Определение противовирусной активности лейкотонового красного цвета в отношении PEDV с помощью иммунофлюоресценции (IFA). Масштаб: 100 мкм. Каждый набор данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение по результатам трёх независимых экспериментов (n = 3). Статистическая значимость определялась с помощью t-критерия Стьюдента.
Рис. 2. Противовирусное действие пандрактола в разные моменты времени после инфицирования клеток PEDV. (A) Определение с помощью RT-qPCR ингибирования пандрактолом транскрипции гена N PEDV в клетках Vero E6 через 12, 24 и 36 ч после инфицирования (hpi). (B) Определение с помощью метода TCID50 ингибирования пандрактолом образования потомственных вирусов в указанные моменты времени. (C) Вестерн-блоттинг для определения снижения экспрессии белка N PEDV под действием пандрафилина. (D) Анализ плотности уровня белка N PEDV с использованием программного обеспечения ImageJ; значения нормализованы относительно контрольной группы с вирусом через 12 ч после заражения. Данные каждой группы представляют результаты трёх независимых экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Анализ дисперсии с двумя факторами проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0.
Рис. 3. Противовирусное действие лейкотонового красного пигмента на PEDV в клетках Vero E6 при различных дозах инфекции. (A) Ингибирование транскрипции гена N PEDV лейкотоновым красным пигментом при MOI 0,01, 0,1 и 1, определённое методом RT-qPCR. (B) Ингибирование образования потомства вируса апином при указанных значениях MOI, определено методом TCID50. (C) Снижение экспрессии белка N PEDV под действием лейгонтонового красного, определено методом вестблутинга. (D) Анализ плотности уровня белка N с использованием программного обеспечения ImageJ, нормированный по контрольной группе, инфицированной с MOI 0,01. Каждый набор данных представляет результаты трёх независимых экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Затем с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 был проведён двухфакторный дисперсионный анализ. 3.2 Легонтоновый красный пигмент проявляет устойчивую противовирусную активность в отношении PEDV. Противовирусный эффект легонтонового красного пигмента был дополнительно оценен через 12, 24 и 36 ч после заражения (hpi). Анализ RT-qPCR показал, что во все исследуемые моменты времени лейгонтонг-редоксин значительно подавлял уровень мРНК гена N PEDV (рис. 2A). Аналогично, определение TCID50 показало, что после обработки лейгонтонг-редоксином титр PEDV в потомстве снижался (рис. 2B). Анализ вестерн-блоттинга показал, что в присутствии лейгонтонового красного пигмента экспрессия белка N PEDV оставалась сниженной во все три временные точки (рис. 2C), а анализ оптической плотности дополнительно подтвердил это снижение (рис. 2D). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что лейгонтоновый красный пигмент оказывает постоянное ингибирующее действие на репликацию и синтез белков PEDV на протяжении всего цикла инфекции.
3.3 Легонтоин способен подавлять инфекцию PEDV при различных дозах заражения. Антивирусная эффективность легонтоина оценивалась при MOI 0,01, 0,1 и 1. Анализ RT-qPCR показал, что при всех значениях MOI легонтоин значительно подавлял уровень мРНК гена N PEDV (рис. 3A). Соответственно, определение TCID₅₀ показало, что лейгонтонг-редоксин снижает титр потомственных вирусов PEDV (рис. 3B), а анализ методом вестерн-блоттинга подтвердил снижение экспрессии белка N (рис. 3C). Анализ оптической плотности дополнительно подтвердил это снижение (рис. 3D). Таким образом, эти результаты показывают, что лейгонтонг-редоксин эффективно подавляет репликацию и синтез белков PEDV при различных дозах инфицирования.
3.4. Поскольку репутоферин воздействует на поздние стадии инфицирования PEDV, мы провели эксперименты с добавлением вещества в разное время, чтобы выяснить, на какой стадии жизненного цикла PEDV он оказывает влияние (рис. 4A). Клетки Vero E6 были разделены на пять групп и обработаны 0,5 мкМ лейгонтоновым красным: контрольная группа (только инфицирование), группа «весь период» (-4–24 ч после инфицирования), группа «предварительная обработка» (-4–0 ч после инфицирования), группа «во время проникновения» (0–1 ч после инфицирования) и группа «после проникновения» (1–24 ч после инфицирования). Анализ RT-qPCR показал, что транскрипция гена N PEDV была значительно снижена в группах «на протяжении всего периода» и «после проникновения», в то время как в группах «предварительная обработка» и «во время проникновения» такого снижения не наблюдалось (рис. 4B). Аналогично, определение TCID₅₀ показало, что по сравнению с контрольной группой титр потомственных вирусов в группах «на протяжении всего периода» и «после проникновения» был значительно снижен (рис. 4C). Анализ вестерн-блоттинга подтвердил, что экспрессия белка N PEDV была значительно снижена только в группах «полный курс» и «после проникновения» (рис. 4D). Результаты ИФА дополнительно подтвердили эти данные (рис. 4E). Вирулицидные тесты показали, что обработка регонгтоном не оказывает прямого инактивирующего действия на вирусные частицы PEDV (рис. 4F). Кроме того, мы проверили влияние регонгтона на высвобождение вируса. После обработки регонгтоном титры вируса как внеклеточно, так и внутриклеточно снизились (рис. 4G, H). Однако соотношение внеклеточных и внутриклеточных титров вируса осталось неизменным (рис. 4I), что указывает на то, что регонгтон не влияет на эффективность высвобождения вируса. Кроме того, путем обнаружения промежуточных форм двухцепочечной РНК (дцРНК) вируса мы подтвердили, что регонгтон ингибирует синтез РНК PEDV (рис. 4J). Таким образом, эти результаты показывают, что лейгонгтонг-рубифлин в основном воздействует на поздние стадии инфекции PEDV, ингибируя синтез вирусной РНК и экспрессию белков, но не влияя на проникновение вируса, его прямую инактивацию или высвобождение.
3.5 Сетевая фармакология указывает на участие сигнального пути апоптоза в активности лейгонтонового красного С помощью баз данных SwissTargetPrediction и SymMap было проведено прогнозирование мишеней, в результате чего было идентифицировано 379 потенциальных мишеней лейгонтонового красного. Используя базы данных Genecards, CTD и TTD, было получено 3830 вирус-ассоциированных мишеней. Анализ пересечения показал, что 238 пересекающихся мишеней могут участвовать в противовирусном действии лейгонтонового красного пигмента (рис. 5A). Для этих общих мишеней был проведен анализ обогащения по GO и KEGG, а с помощью Cytoscape 3.10.3 была построена сеть PPI, содержащая 183 узла. В десятку основных белков, ранжированных по степени, вошли MAPK1, MAP3, IL6, CASP3, AKT1, IL1B, MAPK8, NFKB1 и TP53 (рис. 5B). С помощью анализа докинга в AutoDock была оценена аффинность связывания регонгтонового красного пигмента с десятью ключевыми белками; энергия связывания приведена в табл. 2. Кроме того, модели докинга продемонстрировали образование водородных связей между регонгтоновым красным пигментом и этими белками (дополнительная информация: рис. S1).
Анализ обогащения GO показал, что ингибирование репликации PEDV лейкотоном может быть связано с такими процессами, как положительная регуляция транскрипции РНК-полимеразой II, воспалительная реакция, регуляция апоптоза, экспрессия генов, реакция клеток на механические стимулы и фактор некроза опухолей, транскрипция miRNA, а также сигнальная передача NF-κB (рис. 5C). Анализ обогащения KEGG дополнительно подчеркивает, что апоптоз является наиболее значительно обогащенным сигнальным путем (рис. 5D).
Таблица 2. Энергия свободного связывания рейгонтонового красного пигмента с десятью основными белками
3.6 Легустофлин индуцирует ROS-опосредованную апоптоз, подавляя PEDV. Сетевой фармакологический анализ определил, что сигнальные пути апоптоза являются основными мишенями легустофлина, что побудило нас к дальнейшему изучению его роли в противовирусной активности против PEDV. Анализ вестерн-блоттинга показал, что по сравнению с контрольной группой с имитацией инфекции в клетках, инфицированных PEDV, через 24 часа после заражения (hpi) уровень про-каспазы-3 снизился, что свидетельствует о расщеплении каспазы-3 (рис. 6A, B). Обработка репатолином дозозависимым образом дополнительно усиливала это расщепление, приводя к образованию заметных фрагментов расщепленной каспазы-3. Примечательно, что обработка лейкотонином в одиночку дозозависимым образом индуцировала активацию каспазы-3, сопоставимую с действием индуктора апоптоза астраципина, и этот эффект был устранен ингибитором пан-каспаз Z-VAD-FMK (рис. 6C), что подтверждает, что лейкотонин по сути может инициировать апоптоз. Кроме того, независимо от того, проводилось ли лечение регонгтоном, во всех группах, инфицированных PEDV, наблюдалось снижение экспрессии Bcl-2 (рис. 6D). В целом эти данные подтверждают, что регонгтон усиливает PEDV-индуцированную апоптоз.
Учитывая, что чрезмерное накопление внутриклеточных АФК может инициировать апоптоз, мы далее исследовали роль АФК в контексте действия регонтофенола. По сравнению с контрольной группой регонтофенол дозозависимо индуцировал накопление АФК и дополнительно усиливал индуцированное PEDV образование АФК, при этом Rosup выступал в качестве положительного контроля (рис. 6E). Чтобы более подробно изучить связь между накоплением АФК и противовирусной активностью лейгонтонового красного, мы инкубировали клетки совместно с лейгонтоновым красным и ингибитором АФК N-ацетилцистеином (NAC). Результаты RT-qPCR, TCID₅₀ и вест-блоттинга показали, что NAC устранял ингибирующее действие лейгонтонового красного на синтез вирусной РНК, вирусную титру и экспрессию белка N (рис. 6F–H). Кроме того, мы определили уровни АФК и маркеры апоптоза в клетках, инфицированных PEDV, через 12 и 24 ч после заражения (дополнительная информация: рис. S2A). Результаты показали, что уровень АФК в клетках, инфицированных PEDV, повышался через 24 ч после заражения. Обработка регонтоном повышала уровень АФК, начиная с 12 ч после заражения, и этот эффект сохранялся до 24 ч после заражения, после чего значительного увеличения не наблюдалось. Кроме того, через 24 ч после заражения (hpi) инфицированные PEDV клетки, обработанные лейгонтоном, демонстрировали более выраженную активацию каспазы-3 по сравнению с 12 ч после заражения (hpi), что указывает на то, что образование АФК предшествует активации каспазы-3 (дополнительная информация: рис. S2B).
Мы дополнительно исследовали, может ли ингибитор апоптоза Z-VAD-FMK, подобно NAC, нивелировать противовирусную активность лейгонтона. Мы провели эксперименты по совместной обработке Z-VAD-FMK и репутонол. Анализ MTT показал, что ни отдельная обработка Z-VAD-FMK, ни совместная обработка Z-VAD-FMK и репутонолом не вызывали заметной цитотоксичности (дополнительная информация: рис. S3A). Однако совместная инкубация регонгтонового красного пигмента с ингибитором апоптоза Z-VAD-FMK не устранила его противовирусную активность в отношении PEDV, что проявилось в отсутствии изменений уровней N-белка PEDV (дополнительная информация: рис. S3B) и вирусной РНК (дополнительная информация: рис. S3C), что указывает на то, что противовирусное действие регонгтонового красного пигмента опосредуется главным образом через регуляцию АФК, а не путем прямой индукции апоптоза.
Эти результаты показывают, что лейкотонин ингибирует репликацию PEDV путем индукции накопления АФК, что, в свою очередь, способствует апоптозу.
3.7 Лейгонтонин продемонстрировал противовирусную активность в отношении PDCoV и PRRSV. Клинические случаи инфекции PEDV часто сопровождаются коинфекцией другими вирусами. С целью оценки более широкого противовирусного потенциала лейгонтонового красного пигмента мы проверили его активность в отношении PDCoV (еще одного коронавируса) и PRRSV (важного патогена свиней). Поскольку репликация PDCoV и PRRSV in vitro обычно оценивается на клетках PK-15 и Marc-145, мы сначала оценили цитотоксичность лейгонтонового красного пигмента в этих клеточных линиях. CC₅₀ лейгонтонового красного в клетках PK-15 составила 1,695 мкМ (рис. 7A), а в клетках Marc-145 — 2,638 мкМ (рис. 7D), что свидетельствует о более низкой токсичности в последних. Лейгонтонерин в клетках PK-15 дозозависимым образом (0,1–0,5 мкМ) значительно ингибировал экспрессию мРНК и белка S вируса PDCoV (рис. 7B, C). Аналогичным образом, как показано на рис. 7E и F, лейгонгтенг-рубифлин в том же диапазоне концентраций демонстрировал дозозависимое подавление экспрессии мРНК ORF7 и белка N вируса PRRSV в клетках Marc-145. Эти результаты свидетельствуют о том, что лейгонгтенг-рубифлин обладает противовирусным действием как в отношении PDCoV, так и в отношении PRRSV.
Рис. 4. Подавление реифомтоновым красным пигментом инфекции вирусом эпидемической диареи свиней (PEDV) в клетках VERO E6 (после этапа инвазии). (a) Схема эксперимента с добавлением вещества в разное время. (b) Уровни транскрипции гена N PEDV в различных группах, определенные с помощью количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией (RT-qPCR). (c) Титр дочерних вирусов в различных группах, определенный с помощью получисловой дозы инфекции в тканевой культуре (TCID₅₀). (d) Экспрессия гена N вируса PEDV в различных группах, оцененная с помощью вестерн-блоттинга. (e) Антивирусная активность лейкотонового красного в отношении PEDV, определенная с помощью иммунофлюоресценции (IFA) (масштабная линейка: 50 мкм). (f) Вирулицирующая активность лейкотонового красного цвета в отношении PEDV определялась с помощью эксперимента TCId50. Титры вируса в внеклеточной (g) и внутриклеточной (h) средах определялись с помощью эксперимента TCId50. (i) Рассчитывалось соотношение внеклеточных и внутриклеточных титров вируса для оценки эффективности высвобождения вирусных частиц. (j) Клетки VERO E6, инфицированные PEDV с мультипликативным индексом инфекции (MOI) 0,1, затем обработанные лейгонтоном и зафиксированные, окрашены антителами к двухцепочечной РНК через 24 часа после инфицирования (масштаб: 50 мкм). Каждый набор данных представляет результаты трёх независимых экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Для сравнения данных использовался t-критерий Стьюдента.
Рис. 5. Сетевой фармакологический анализ мишеней вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) с участием рейгонтонового красного пигмента. (A) Диаграмма Венна, демонстрирующая пересечение между точками, соответствующими рейгонтоновому красному пигменту, и точками, соответствующим вирусным мишеням. (B) Сеть взаимодействий белков (PPI) общих мишеней, построенная с помощью Cytoscape 3.9.0. (C) Анализ общих мишеней с помощью GO (Генетическая онтология). (D) Анализ общих мишеней с помощью KEGG (обогащение путей).
4. Инфекция PEDV и его способность ускользать от иммунной системы представляют собой серьезный вызов для разработки вакцин. Поэтому поиск альтернативных стратегий, таких как противовирусные препараты, имеет решающее значение для профилактики и борьбы с PEDV. В последние годы в разработке противовирусных препаратов против PEDV достигнуты значительные успехи, и изучение механизмов их действия, а также выявление новых мишеней для борьбы с вирусом имеют большое значение.
В данной работе мы продемонстрировали противовирусную активность лейгонтонового красного пигмента, который ингибирует репликацию PEDV на поздних стадиях проникновения и стимулирует апоптоз, опосредованный активными формами кислорода (ROS). Ранние исследования показали, что лейгонтоновый красный пигмент обладает вирулицидным действием в отношении SARS-CoV-2 за счет прямого связывания с белком S. Однако результаты нашего исследования показывают, что лейгонтоновый красный пигмент ингибирует поздние стадии проникновения PEDV, но не оказывает ингибирующего действия на сам процесс проникновения вируса или его прямую инактивацию. Учитывая, что PEDV и SARS-CoV-2 являются коронавирусами, эти результаты указывают на то, что механизм противовирусного действия лейгонтонового красного пигмента может различаться в зависимости от вируса.
Рис. 6. Лейгоунтонин подавляет инфекцию вирусом эпидемической диареи свиней (PEDV) путем ингибирования апоптоза, вызванного этим вирусом. (A) Через 24 часа после инфицирования (24 hpi) проводили вестерн-блоттинг для анализа белков N-протеина PEDV, каспазы-3 (caspase-3), расщеплённой каспазы-3 (cleaved caspase-3) и белка Bcl-2. (B–D) С помощью программы ImageJ был проведен количественный анализ интенсивности полос белков каспазы-3, расщепленной каспазы-3 и Bcl-2, стандартизация которых осуществлялась с использованием β-актина в качестве внутреннего стандарта; данные сравнивались с результатами группы отрицательного контроля. (E) Определение уровня активных форм кислорода (ROS) в клетках по интенсивности флуоресценции DCF; шкала = 50 мкМ. (F) Определение уровня транскрипции гена N вируса PEDV в клетках Vero E6 при обработке регонгтоном и NAC с помощью RT-qPCR. (G) Определение титра вируса PEDV в клетках Vero E6 при обработке регонгтоном и NAC с помощью метода TCID50. (H) Определение уровня белка N вируса PEDV в клетках Vero E6 при обработке регонгтоном и NAC с помощью метода вестерн-блоттинга. Каждая точка на графике представляет результаты трёх независимых экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Сравнение данных проводилось с помощью t-критерия Стьюдента.
Рис. 7. Противовирусная активность целастрола в отношении свиного дельта-коронавируса (PDCoV) и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), а также его цитотоксичность в клетках PK-15 и Marc-145. (A) Цитотоксичность целастрола в клетках PK-15; значение CC50 рассчитано с помощью GraphPad Prism 8.0. (B) Целастрол ингибирует транскрипцию гена S PDCoV в клетках PK-15. (C) Целастрол ингибирует экспрессию белка N вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) в клетках PK-15. (D) Оценка цитотоксичности целастрола в клетках Marc-145. (E) Легонтоин ингибировал транскрипцию гена ORF7 вируса PRRSV в клетках Marc-145. (F) Легонтоин ингибировал экспрессию белка N вируса PRRSV в клетках Marc-145. Каждый набор данных представляет результаты трёх независимых экспериментов (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Сравнение данных проводилось с помощью t-критерия Стьюдента.
Апоптоз представляет собой внутренний защитный механизм хозяина, который подавляет репликацию вируса путем удаления инфицированных клеток. Однако PEDV двунаправленно регулирует апоптоз в своих интересах: он подавляет апоптоз в инфицированных клетках, создавая благоприятную среду для репликации потомственных вирусов, и одновременно использует апоптоз для ускорения высвобождения и распространения потомственных вирусов. Кроме того, PEDV индуцирует апоптоз через путь AIF и путь каспазы-8, активируемый рецептором DR5; ингибирование экспрессии AIF и DR5 значительно нарушает индуцированный PEDV апоптоз и репликацию вируса. Напротив, PEDV кодирует ряд вирусных белков, играющих ключевую роль в подавлении апоптоза. Например, белок ORF3 PEDV способствует пролиферации вируса в клетках-хозяевах за счёт подавления апоптоза инфицированных клеток. Белок nsp9 PEDV взаимодействует с гистопротеином H2BE хозяина, подавляя индуцированный PEDV апоптоз, опосредованный стрессом эндоплазматического ретикулума (ЭР), и тем самым способствуя репликации вируса. Таким образом, взаимосвязь между инфекцией PEDV и апоптозом по-прежнему остаётся предметом споров. Наши результаты показывают, что PEDV индуцирует апоптоз, а регонтоин значительно усиливает этот эффект. Аналогичные наблюдения были сделаны и в отношении других ингибиторов PEDV. Например, было доказано, что триацетилресвератрол ингибирует PEDV путем индукции раннего апоптоза, что приводит к элиминации инфицированных PEDV клеток.
В процессе апоптоза дисфункция митохондрий и других клеточных органелл приводит к увеличению образования АФК, что, в свою очередь, усиливает апоптоз посредством цикла положительной обратной связи. Согласно предыдущим исследованиям, левистолид А может инициировать АФК-опосредованный апоптоз и повышать уровень АФК. В то же время штаммы PEDV активируют в клетках Vero E6 путь PERK/eIF2α, что приводит к увеличению образования АФК. В соответствии с нашими данными, аналогичный противовирусный механизм наблюдается у левистолида А, который подавляет репликацию PEDV путем индукции образования АФК и стимуляции эндоплазматического ретикулярного стресса. Однако совместная инкубация регонгтонового красного пигмента с ингибитором апоптоза Z-VAD-FMK не устраняла его противовирусную активность в отношении PEDV, что указывает на то, что противовирусное действие регонгтонового красного пигмента в основном связано с регуляцией АФК, а не с прямой индукцией апоптоза. Например, исследования показывают, что АФК, образующиеся во время инфекции респираторно-синцитиальным вирусом, могут активировать противовирусный иммунный ответ хозяина, тогда как подавление образования АФК ослабляет этот ответ. Это указывает на то, что АФК, возможно, играют более ключевую роль в механизме противовирусного действия лейгонтонового красного пигмента, а апоптоз является лишь последующим эффектом регуляции АФК.
Тем не менее, в данном исследовании остались некоторые нерешенные вопросы, которые требуют более углубленного изучения в будущем. Например, нам не удалось определить фармакологические мишени лейгонтонового красного пигмента. Углубленное изучение мишеней лейгонтонового красного пигмента в борьбе с PEDV и всестороннее понимание его механизма действия не только поддержат его клиническое применение, но и помогут прояснить взаимодействие между PEDV и хозяином. Недавние достижения в области протеомики, включая химическую протеомику, белковые микроматрицы, спектрометрический анализ белков на основе деградации, бесконтрастные методы на уровне всего протеома, сетевую фармакологию, скрининг лекарственных средств на основе мишеней, мультиомический анализ и подтверждение мишеней на основе гипотез, позволили выявить многогранный механизм действия регонгтон-редофилла. Идентификация многочисленных мишеней регонгтон-редофилла подчеркивает его потенциал в качестве многоцелевого терапевтического средства. Последующий анализ, включая оценку сетевых взаимодействий и частоты встречаемости этих мишеней, указывает на то, что PRDX, HMGB1, HSP90, STAT3 и PKM2, вероятно, являются ключевыми мишенями лейгонтонового красного пигмента. Необходимо провести более углубленные исследования в будущем, чтобы выяснить, связаны ли эти описанные мишени лейгонтонового красного пигмента с его способностью противостоять PEDV или играют ли они важную роль в инфекции PEDV. С другой стороны, крайне важно оценить эффективность противовирусных препаратов in vivo. Однако мы пока не проводили экспериментов in vivo для оценки противовирусного действия регонгтонового красного пигмента против PEDV. Регонгтоновый красный пигмент уже использовался в клинических исследованиях, и имеющиеся на данный момент данные свидетельствуют о крайне низкой частоте побочных эффектов и отсутствии значительных проблем с безопасностью. Таким образом, в будущих исследованиях антивирусных свойств лейгонтонового красного в отношении PEDV следует в первую очередь определить мишени действия препарата, выяснить конкретные механизмы противодействия PEDV и оценить его противовирусную эффективность у свиней.
Кроме того, мы оценили противовирусную активность лейгонтонового красного in vitro в отношении PRRSV и PDCoV, что свидетельствует о перспективности использования лейгонтонового красного в качестве противовирусного препарата против более широкого спектра свиных вирусов. Однако из-за нехватки экспериментального материала другие важные вирусы свиней, такие как вирус африканской чумы свиней, вирус классической чумы свиней и вирус свиного гриппа, пока не прошли дальнейшую проверку. Дальнейшая проверка противовирусного действия лейгонтонового красного в отношении большего числа вирусов свиней в будущем обеспечит более полную теоретическую основу для коммерциализации лейгонтонового красного в качестве противовирусного препарата.
В целом, наше исследование подтвердило противовирусную активность лейгонтонового антоциана, выявило его ингибирующее действие на репликацию PEDV и впервые подтвердило участие активных форм кислорода (ROS) в его противовирусном механизме. Эти открытия имеют важное значение для профилактики и борьбы с PED. Наше исследование предоставляет ценную информацию для определения потенциальных лекарственных мишеней, что может способствовать разработке новых мер вмешательства.
5. Выводы. В данном исследовании на основе всесторонних экспериментов in vitro и сетевого фармакологического анализа было доказано, что лейгонтонин подавляет репликацию вируса PEDV путем стимулирования апоптоза, опосредованного активными формами кислорода (ROS). Эти результаты подчеркивают потенциал лейгонтонина в качестве эффективного противовирусного препарата против PEDV, создают новую теоретическую основу для разработки противовирусных препаратов против PEDV и способствуют всестороннему контролю над инфекцией PEDV.
