Усиливающее действие белка ядра вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) на трансляцию вирусной РНК 

Резюме

Роль белка нуклеокапсида (N) коронавируса в регуляции вирусной трансляции до сих пор неясна. В данной работе мы обнаружили, что белок N вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) способен усиливать трансляцию вирусной геномной РНК (gRNA) и матричной РНК. Дальнейшая характеристика усиления трансляции gRNA показала, что основную роль играют N-концевой домен (NTD) и соединительная область (Linker). Стебель-петля 1 (SL-1) в 5′-нетранслируемой области (UTR) и выпуклая стебель-петля (BSL) в 3′-UTR необходимы для усиления вирусной трансляции белком N PEDV.
Существует три подтипа сигнальной киназы Akt. Мы обнаружили, что Akt1 усиливает повышение трансляции вирусной gRNA, что зависит от его киназной активности и требует присутствия N-белка. Мы также доказали наличие взаимодействия между Akt1 и N-белком PEDV, при этом область NTD + Linker устраняет это взаимодействие. Это указывает на то, что усиливающее действие Akt1 на опосредованное N-белком повышение трансляции не требует прямого взаимодействия между этими двумя белками.

Введение

Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) относится к роду Альфа-коронавирусов семейства Коронавирусов и вызывает эпидемическую диарею свиней (PED), которая характеризуется рвотой, диареей, обезвоживанием и потерей аппетита у свиней всех возрастов, причём у поросят она приводит к тяжёлой диарее. PEDV был впервые описан в 1970-х годах в Великобритании, после чего о нем стали поступать сообщения и из других стран Европы. С 2010 года начали распространяться высокопатогенные штаммы PEDV, приводящие к 100%-ной смертности поросят.
PEDV представляет собой оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с положительной полярностью, длина генома которого составляет около 28 кб. Геном вируса содержит 5′-кап-структуру, 3′-полиаденин (A)-хвост и по меньшей мере семь открытых рамок считывания (ORF), включая гены ORF1a, ORF1b, спайкового белка (S), ORF3, белка оболочки (E), мембранного белка (M) и ядерного белка (N). После проникновения вируса геномная РНК (gRNA) транслируется в полипротеины ORF1a и ORF1ab, основной функцией которых является формирование комплекса репликации-транскрипции. Путем неконтинуальной транскрипции образуется серия вложенных субгеномных РНК отрицательной цепи, которые впоследствии транскрибируются в вирусоподобные мРНК, кодирующие структурные и вспомогательные белки вируса. PEDV содержит четыре структурных белка — S, E, M и N, а также один вспомогательный белок ORF3.
Белок N представляет собой широко распространенный и высококонсервативный белок, который связывается с РНК-геномом вируса и обеспечивает структурную основу для спиралевидной нуклеокапсы. Он состоит из двух доменов: N-концевого домена (NTD) и C-концевого домена (CTD), оба из которых участвуют в связывании с РНК, а CTD также участвует в димеризации. По обе стороны от NTD и CTD расположены по два внутренних беспорядочных участка (IDR), называемых N-плечом и C-плечом (рис. 3а). Кроме того, центральная связующая область (LKR) соединяет два домена. Предыдущие исследования показали, что LKR белка N участвует в связывании РНК. N-концевой домен и домен, богатый серином и аргинином (SR), белка N коронавируса подвергаются фосфорилированию, что регулирует функции белка N, такие как связывание РНК и репликация вируса. Подобно белкам N других коронавирусов, белок N PEDV, помимо образования нуклеокапса, выполняет множество функций.

Связывается с РНК генома вируса. Исследования также показали, что белок N PEDV способен усиливать репликацию PEDV в клетках Vero E6. Кроме того, белок N PEDV подавляет противовирусную реакцию, противодействуя выработке интерферона, ингибируя выработку IFN-β и экспрессию генов, стимулируемых интерфероном.
Несмотря на то что трансляция РНК является важным этапом жизненного цикла коронавирусов, наши знания о том, как регулируется этот процесс, остаются ограниченными. Аналогичным образом, влияние N-белка коронавируса на трансляцию вируса также остается не до конца ясным. Исследования показывают, что N-белок вируса гепатита мышей способен активировать трансляцию РНК вирусного генома. Недавнее исследование показало, что N-белок PEDV стимулирует трансляцию вирусной репортерной РНК, содержащей только полноразмерный 5′-UTR, путем образования комплекса с боковым выступом субъединицы рибосомального белка RPLp2 и эукариотическим фактором инициации трансляции 4E.
Akt — это серино-/таурино-протеинкиназа, также известная как протеинкиназа B (PKB), структура которой схожа со структурой протеинкиназы A (PKA) и протеинкиназы C (PKC). Сигнальный путь Akt участвует во многих клеточных процессах, включая регуляцию белковой трансляции посредством модуляции комплекса mTOR (мишень репамицина у млекопитающих) и содействия сборке фактора инициации трансляции eIF4E. Akt существует в виде трёх подтипов: Akt1, Akt2 и Akt3. Akt представляет собой растворимый цитоплазматический белок с молекулярной массой 57 кДа, обладающий тремя консервативными доменами: N-концевым доменом, гомологичным пресубстрату (PH), центральным каталитическим киназным доменом и C-концевым доменом. Структура доменов всех трех подтипов Akt схожа. Среди этих подтипов Akt наиболее тщательно изучен Akt1, который распределен по всему организму и играет ключевую роль в сигнальном пути PI3K/Akt/mTOR. Было обнаружено, что Akt2 участвует в регуляции глюкозного гомеостаза и экспрессируется преимущественно в тканях, реагирующих на инсулин. Akt3 высоко экспрессируется в головном мозге, однако о его функции и связи с вирусной инфекцией пока известно очень мало. Примечательно, что было обнаружено, что как Akt1, так и Akt2 могут активироваться в результате вирусной инфекции и участвуют в регуляции вирусной репликации и трансляции. Кроме того, исследования показали, что коронавирусы, включая PEDV, свиной коронавирус типа D и SARS-CoV-2, также могут активировать Akt. Однако вопрос о том, влияют ли подтипы Akt на трансляцию PEDV, пока не выяснен.

В рамках данного исследования мы обнаружили, что N-белок способствует усилению трансляции РНК PEDV. Мы также изучили роль нетранслируемых участков в регуляции трансляции PEDV со стороны N-белка. Кроме того, мы доказали, что Akt1 значительно усиливает эффект N-белка PEDV по усилению трансляции. Мы также продемонстрировали наличие взаимодействия между N-белком PEDV и Akt1, причём это взаимодействие не является обязательным для регуляции трансляции.

Рис. 1. Репортерный ген, транслируемый вирусом PEDV. ** (a и b) Схематическое изображение (a) и нуклеотидная последовательность (b) репортерного гена нанолюминезы (nLuc), транслируемого РНК PEDV. Фрагмент, содержащий 5′-UTR PEDV (черный), первые 54 нуклеотида ORF1a (зеленый), кодирующую последовательность nLuc (желтый), 3′-UTR вируса PEDV (синий) клонированы между промотором цитомегаловируса (pCMV) и поли-A-последовательностью (серый). На рисунке (c) 5′-UTR заменен промоторной последовательностью гена мембранного белка (M) и последовательностью регуляции транскрипции (TRS).

Материалы и методы

Конструирование плазмид и репортерных генов трансляции

Все плазмиды были сконструированы в соответствии со стандартными методами и, при необходимости, подтверждены с помощью ДНК-секвенирования. Конструкция репортерного гена для трансляции вирусоподобной gRNA включала 5′-UTR PEDV, первые 54 нуклеотида ORF1a, ген нанолюминезы (nLuc), 3′-UTR PEDV, а также поли-A-последовательность, расположенную ниже промотора цитомегаловируса (pCMV) (рис. 1а и б). Аналогичные репортерные гены уже использовались для изучения трансляции РНК других коронавирусов. Данный репортерный ген был использован для разработки других репортерных генов, лишенных всего 5′-UTR (Δ5’UTR), 5′-UTR SL-1, всего 3′-UTR (Δ3’UTR) или отдельных функциональных доменов 3′-UTR. Мы также сконструировали вирусоподобный мРНК-репортерный ген путем замены последовательности 5′-UTR на промоторную последовательность и последовательность регуляции транскрипции (TRS) гена мембранного белка (M) (рис. 1c).
Кодирующие последовательности белка N PEDV и его различных доменов были получены путем ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы плазмиды, содержащей последовательность белка N штамма PEDV Colorado-2013, а также праймеров, приведённых в табл. 1, с последующим клонированием в вектор экспрессии pEF с промотором фактора экспансии-1α. К N-концу белка N был добавлен флаг-тег.
Для создания плазмид, экспрессирующих отдельные подтипы Akt, были синтезированы кодирующие последовательности свиных Akt1, Akt2 и Akt3 (Thermo Fisher Scientific GeneArt) и клонированы вместе с Myc-меткой в вектор pcDNA3.1. С помощью Block-IT RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific) были разработаны shRNA, специфичные к свиному Akt1, и клонированы в слоувирусный вектор pLKO.1. Путем точечной мутации был создан киназный неактивный мутант Akt1 (Akt1 K179M). Кодирующие последовательности отдельных доменов Akt1, слиянных с GST с тег-маркером Flag, были клонированы в вектор pEF. В качестве контроля использовался вектор pEF, экспрессирующий GST с тег-маркером Flag.

Для проведения экспериментов по субклеточной локализации кодирующие последовательности EGFP и слияного белка EGFP-PEDV N были клонированы в вектор pEF с флагом Flag. Одновременно были созданы плазмиды, экспрессирующие RFP и слияный белок RFP-Akt1 с тегом Myc. Плазмиды для комплементарного анализа с помощью расщепленной люминеза (SLCA), кодирующие белок люминезы морского почки LN (аминокислоты 1–229) или LC (аминокислоты 230–311), были получены, как описано ранее. Кодирующие последовательности полноразмерного белка N вируса PEDV с тег-маркером Flag или его различных доменов клонировали в плазмиду SLCA LN, а кодирующую последовательность Akt1 с тег-маркером Myc — в плазмиду SLCA LC.

Клеточные линии и трансфекция

Клетки HEK293 культивировали в модифицированной среде Дульбеко (DMEM), дополненной 5 % (об./об.) сывороткой плода теленка (FBS) и 1 % пенициллином-стрептомицином, и инкубировали при 37 °C и 5 % CO₂. Клетки VIDO R1 и клетки свиной почки PK15 культивировали в модифицированной среде Игеля (MEM), дополненной 5 % (об./об.) FBS и 1 % пенициллина-стрептомицина, и инкубировали при 37 °C и 5 % CO₂. Трансфекцию плазмидной ДНК проводили с использованием реагентов Jet-PEI (Polyplus-Transfection) или Lipofectamine™ 3000 (Thermo Fisher Scientific).

Таблица 1. Праймеры для ПЦР-амплификации.

Примечание: все последовательности праймеров в исходном тексте одинаковы, что явно является ошибкой; в реальных экспериментах следует использовать специфические праймеры, разработанные для различных доменов.

Анализ люминеза

Через 48 часов после трансфекции клетки собирают и лизируют с помощью буфера пассивного лизиса (Passive Lysis Buffer, Promega). Активность люминезы измеряют методом двойной люминезы с использованием люминесцентного детектора GloMax 20/20 в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Данные представлены в виде нормализованной относительной активности нано- или морской люминезы по отношению к показаниям светлячковой люминезы.

Экстракция РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

РНК из трансфицированных клеток HEK293 экстрагировали с помощью набора RNeasy mini kit (Qiagen). Образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific), а затем проводили обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием набора iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) и случайных гексамерных праймеров (Thermo Fisher Scientific). ПЦР в реальном времени проводили с использованием SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и праймеров nLuc-FD (5′ CATCATCCCGTATGAAGGTC 3′) и nLuc-rev (5′ CGATTACCGAGTGTCACAAGG 3′). Одновременно определяли уровень транскрипции GAPDH с помощью праймеров GAPDH-FD (5′ AAGCTGAAGGTCGGAGGTC 3′) и GAPDH-rev (5′ GGTGGAGGTCATACTGGAGG 3′) для нормализации результатов.

GST-пулдаун и вестерн-блоттинг

Как уже упоминалось ранее, эксперименты по GST-пулдауну проводили с использованием клеточных лизатов в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) и агарозовых шариков с глутатионом 4B (GE Healthcare). Для вестерн-блоттинга белки разделяли с помощью 10 %-ного SDS-PAGE, а затем переносили на нитратцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали в растворе PBS с 5 % обезжиренного молока в течение 1 часа, а затем инкубировали с первичным антителом при 4 °C в течение ночи. После промывки мембрану инкубировали со вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) мембрану сканировали с помощью сканера Li-Cor Odyssey (ODY-CLx). Антитела против β-актина и Myc были приобретены у компании Cell Signaling Technology. Антитело против Flag было приобретено у компании MilliporeSigma. Вторичные антитела IRDye 800CV (козье антитело против мышиного IgG) и IRDye 680 BD (козье антитело против кроличьего IgG) были приобретены у компании Li-Cor Biosciences.

Анализ субклеточной локализации белков с помощью конфокального микроскопа

Клетки, трансфицированные белками, меченными EGFP или RFP, в двухкамерных предметных стеклах фиксировали 4 %-ным полиформальдегидом в течение 20 минут. Затем ядра клеток окрашивали 300 нМ DAPI (Thermo Fisher Scientific) в течение 5 минут. После промывки и сушки на воздухе препараты фиксировали с помощью реагента ProLong Antifade (Thermo Fisher Scientific). Все этапы проводили при комнатной температуре. Наблюдение за клетками и фотографирование осуществляли с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems).

Статистический анализ: все эксперименты проводились в трёх повторностях, а анализ экспериментальных данных осуществлялся с помощью программы GraphPad Prism 9. Статистически значимые различия определялись с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Статистическая значимость обозначается следующим образом: * — если \( P < 0,05 \); ** — если \( P < 0,01 \); *** — если \( P < 0,001 \); **** — если \( P < 0,0001 \); ns — не значимо.

Результаты

Белок N вируса PEDV усиливает трансляцию вирусной РНК

Чтобы определить роль белка N вируса PEDV в трансляции РНК вируса PEDV, мы создали репортерный ген трансляции РНК PEDV. Подобно репортерным генам, используемым для изучения трансляции РНК коронавирусов, наш репортерный ген трансляции PEDV содержит ген нанолюминеза (nLuc), по обе стороны от которого расположены 5′-UTR штамма PEDV Colorado-2013 (GenBank: KF272920.1), а также первые 54 нуклеотида ORF1a и последовательность 3′-UTR, расположенные между промотором цитомегаловируса (CMV) и поли-А-последовательностью на C-конце (рис. 1а и б).

Мы также клонировали кодирующую последовательность белка N PEDV с флаг-тегом на N-конце в вектор экспрессии. Клетки HEK293, восприимчивые к инфекции PEDV, подвергали котрансфекции плазмидой, экспрессирующей белок N PEDV, плазмидой, кодирующей репортерный ген nLuc, а также плазмидой pGL4.10 (Promega) для экспрессии светлячковой люминеза (fLuc), используемой для нормализации. В качестве контроля при трансфекции использовались EGFP с Flag-меткой, GST с Flag-меткой или пустой вектор. Вирусную трансляцию измеряли по активности nLuc, нормализованной по показателям fLuc для того же образца. По сравнению с пустым вектором, а также с экспрессией EGFP и GST, экспрессия белка N PEDV демонстрировала значительное увеличение активности nLuc (рис. 2а). Экспрессия белка N PEDV с тег-маркером Flag, EGFP и GST была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag (рис. 2b). В качестве контроля загрузки был определен уровень β-актина с помощью антител против β-актина (рис. 2b). По сравнению с пустым вектором, а также с экспрессией EGFP или GST, белок N PEDV не влиял на уровень РНК репортерного гена вирусной трансляции (рис. 2c). Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемое повышение уровня трансляции является специфичным для клеток HEK293, мы повторили эксперимент с использованием клеток сетчатки свиньи VIDO R1 (Reddy и др., 1999). Мы вновь подтвердили, что белок N PEDV усиливает трансляцию вируса (рис. 2d). Экспрессия белка была подтверждена методом вестерн-блоттинга (рис. 2e). Эти результаты показывают, что белок N PEDV усиливает трансляцию вирусного gRNA как в человеческих, так и в свиных клеточных линиях. Ввиду простоты пассажирования и трансфекции в большинстве последующих экспериментов мы использовали клетки HEK293.

Имеются убедительные доказательства того, что в ходе жизненного цикла коронавируса образуются различные типы вирусоподобных мРНК, каждая из которых обладает трансляционной способностью. Поэтому мы также определили, регулирует ли белок N PEDV трансляцию вирусоподобных мРНК. С этой целью мы заменили всю последовательность 5′-UTR репортерного гена на промоторную последовательность и последовательность TRS гена M PEDV (рис. 1c) и измерили уровень трансляции при экспрессии белка N. Как показано на рис. 2f, белок N PEDV значительно усиливал трансляцию по сравнению с пустым вектором и экспрессией EGFP. Экспрессия белка была подтверждена методом вестерн-блоттинга (рис. 2g).
Белок N PEDV состоит из доменов N-рукава, NTD, линкера, CTD и C-рукава. Чтобы определить, какой домен белка N отвечает за регуляцию трансляции PEDV, мы создали восемь мутантов, каждый из которых кодирует различные домены белка N с флаговым тегом (рис. 3a). Клетки HEK293 котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими полноразмерный белок N PEDV или его мутанты, а также геном-репортером трансляции. Данные анализа люминезазы показали, что отсутствие области линкера (ΔLinker), экспрессия только домена NTD, комбинация NTD + линкер, а также экспрессия только области линкера способны в той же степени, что и полноразмерный белок N, повышать трансляцию вирусной РНК, тогда как комбинации N-рукав + NTD, линкер + CTD, сам CTD и CTD + C-рукав уже не способны повышать трансляцию вирусной РНК (рис. 3b). Экспрессия различных доменов белка N была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag (рис. 3c). Эти результаты показывают, что экспрессия только домена NTD или области Linker может усиливать трансляцию вирусной РНК. При экспрессии домена NTD и области Linker в виде одного полипептида наблюдался синергетический эффект.

Рис. 2. Белок N вируса PEDV усиливает трансляцию вирусоподобных gRNA и mRNA.** (a и b) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими белок N с флаг-меткой, EGFP, GST или пустой вектор, а также плазмидой pGL4.10, кодирующей репортерный ген nLuc, транслируемый gRNA, и репортерный ген, кодирующий светлячковую люминезану (fLuc). Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминозаны (a) и подтверждали экспрессию белков N-белка PEDV с Flag-меткой, EGFP и GST с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag (b). Одновременно определяли уровень β-актина с помощью антител против β-актина. (c) Уровень РНК nLuc определяли с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. (d и e) Оценка трансляции вируса в клетках VIDO R1 сетчатки плода свиньи проводилась таким же образом, как и в клетках HEK293. (f и g) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими белок N с FLAG-меткой, EGFP или пустой вектор, а также плазмидой pGL4.10, кодирующей репортерный ген nLuc, транслируемый из вирусной мРНК, и репортерный ген светлячка (fLuc). Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминозы (f). * — если \( P < 0,05 \); ** — если \( P < 0,01 \); *** — если \( P < 0,001 \); **** — если \( P < 0,0001 \); ns — не значимо. Экспрессия белка подтверждена методом вестерн-блоттинга (g).

Рис. 3. Влияние доменов белка N вируса PEDV на трансляцию gRNA вируса. (a) Схематическое изображение структуры доменов белка N вируса PEDV и полученных мутантов. (b) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими различные мутанты белка N с флаг-меткой или пустой вектор, gRNA, кодирующий репортерный ген nLuc, а также репортерный ген pGL4.10 fLuc. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминеза. * — если \( P < 0,05 \); ** — если \( P < 0,01 \); *** — если \( P < 0,001 \); **** — если \( P < 0,0001 \); ns — не значимо. (c) Подтверждение экспрессии различных N-мутантов с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag.

В литературе описано, что при наличии только 3′-UTR белок N вируса PEDV в большей степени усиливает трансляцию РНК, чем при одновременном наличии обоих UTR. Как 5′, так и 3′-UTR участвуют во многих этапах жизненного цикла коронавирусов, включая трансляцию вируса. Чтобы понять роль UTR в регуляции трансляции вируса белком N, мы создали несколько репортерных генов трансляции, лишенных последовательностей 5′-UTR или 3′-UTR (рис. 4). После совместной трансфекции гранул белка N PEDV с различными генами-репортерами трансляции мы обнаружили, что при наличии только 3′-UTR белок N PEDV значительно усиливал трансляцию РНК по сравнению с ситуацией, когда присутствовали оба UTR, тогда как при наличии 5′-UTR мы наблюдали снижение трансляции (рис. 4b). Эти результаты указывают на то, что 5′-UTR, возможно, содержит последовательности, приводящие к подавлению трансляции при экспрессии белка N вируса PEDV. Экспрессия белка N и контрольного белка EGFP была подтверждена методом вестерн-блоттинга (рис. 4c).
Недавние исследования показали, что последовательность «стебель-петля 1» (SL-1) в 5′-UTR SARS-CoV-2 играет положительную роль в трансляции вирусной РНК. Вторичные структуры в 5′-UTR коронавирусов, включая структуру SL-1, являются высококонсервативными. Соответственно, 5′-UTR PEDV содержит последовательность SL-1: AAAAA-GAUUUUCUAUCUAGGAUAGUUAGCUCUUUUU. Чтобы оценить, играет ли SL-1 в 5′-UTR PEDV такую же роль в регуляции трансляции белка N из вирусной РНК, мы создали конструкции, в которых последовательность SL-1 отсутствовала в 5′-UTR или сохранялась только в 5′-UTR, независимо от наличия 3′-UTR (рис. 4d). После совместной трансфекции этих трансляционных репортерных генов с гранулами белка N PEDV мы обнаружили, что независимо от наличия или отсутствия 3′-UTR, при наличии SL-1 в 5′-UTR трансляция белка N PEDV значительно увеличивается (рис. 4e). При отсутствии последовательности SL-1 уровень трансляции значительно снижался (рис. 4e). Была подтверждена экспрессия белка (рис. 4f). Эти результаты указывают на то, что последовательность SL-1 в 5′-UTR играет положительную роль в регуляции трансляции белка N вируса PEDV, тогда как остальные последовательности в 5′-UTR, возможно, оказывают негативное влияние.

3′-UTR вируса PEDV состоит из выпуклого стеблевого кольца (BSL), псевдоузла (PK) и высокоизменчивой области (HVR). Чтобы изучить влияние этих отдельных участков 3′-UTR на регуляцию трансляции белка N, мы создали четыре трансляционных репортерных гена с полноразмерным 3′-UTR, ΔBSL, ΔPK или ΔHVR (рис. 4g). Клетки HEK293 подвергали котрансфекции этими генами-репортерами трансляции и плазмидами, экспрессирующими N-белок PEDV. Как показано на рис. 4h, делеция BSL привела к значительному снижению активности nLuc. Напротив, между вариантами ΔPK, ΔHVR и полноразмерным 3′-UTR не было обнаружено значимых различий (рис. 4h). Эти результаты указывают на то, что BSL в 3′-UTR необходим для регуляции трансляции вирусной РНК N-белком PEDV.

Akt1 усиливает эффект N-белка по усилению трансляции вируса посредством своего каталитического домена и киназной активности. Akt участвует в регуляции трансляции клеточной и вирусной РНК. Три подтипа Akt обладают как общими, так и подтипоспецифическими функциями. С целью изучения влияния подтипов Akt на регуляцию трансляции белка N вируса PEDV мы создали плазмиду, экспрессирующую подтипы Akt свиней с Myc-меткой. Плазмиды, экспрессирующие белок N вируса PEDV, три подтипа Akt и репортерный ген трансляции PEDV, были совместно трансфицированы в клетки HEK293. Как показано на рис. 5а, по сравнению с пустым вектором Akt1 значительно усиливал трансляцию РНК, в то время как Akt2 не оказывал никакого эффекта, а Akt3 подавлял трансляцию РНК. Экспрессия белка N и подтипов Akt была подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag-метки (для белка N) или против Myc-метки (для Akt) (рис. 5b). Чтобы подтвердить влияние Akt1 на регуляцию трансляции белка N PEDV, уровень Akt1 был понижен с помощью специфического для Akt1 shRNA (рис. 5d). На рис. 5c показано, что после котрансфекции shRNA усиливающее действие Akt1 на трансляцию PEDV было частично и значительно снижено, что указывает на то, что подавление экспрессии Akt1 устранило его усиливающее действие на трансляцию PEDV, опосредованную белком N PEDV.
Akt1 состоит из трех доменов: N-концевого домена, гомологичного пресубстрату (PH), центрального каталитического киназного домена и C-концевого домена. Чтобы определить, какой из доменов Akt1 отвечает за повышение трансляции, мы сконструировали четыре плазмиды, экспрессирующие различные домены Akt1 в виде GST-фузиона с Myc-меткой, и провели их котрансфекцию в клетки HEK293 вместе с плазмидой, кодирующей белок N PEDV, и репортерным геном трансляции. Наши результаты показывают, что по сравнению с полноразмерным Akt1 экспрессия PH-домена и C-концевого домена коррелирует с более низкой активностью nLuc (рис. 6a). Напротив, центральный каталитический домен киназы не продемонстрировал значимых различий (рис. 6а). Экспрессия различных мутантов Akt1 была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Myc (рис. 6б). Эти результаты указывают на то, что центральный каталитический домен киназы отвечает за усиливающее действие Akt1 на трансляционную активацию, опосредованную белком N вируса PEDV.

Рис. 4. Структурные элементы 5′- и 3′-UTR участвуют в регуляции трансляции gRNA белком N вируса PEDV.** (a, d, g) Схематическое изображение репортерного гена трансляции. (b, e, h) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими белок N с флаг-меткой, различные трансляционные репортерные гены nLuc, а также репортерный ген pGL4.10 fLuc. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминозаны. * — если \(P<0,05\); ** — если \(P<0,01\); *** — если \(P<0,001\); **** — если \(P<0,0001\); ns — не значимо. (c, f) Экспрессия белков подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag. Уровни β-актина определяли с помощью антител против β-актина.

Чтобы дополнительно проверить, является ли киназная активность Akt1 в каталитическом домене необходимой для его участия в регуляции трансляции РНК PEDV, мы создали киназно-неактивный мутант Akt1 путем замены лизинового остатка, связывающего АТФ, в положении 179 на метионин (K179M). Как показаны результаты анализа люминезазы на рисунке 6c, по сравнению с диким типом Akt1 экспрессия киназного мутанта Akt1 с потерей активности значительно снижала усиление трансляции PEDV. Экспрессия белка N PEDV, Akt1 и киназного мутанта Akt1 с потерей активности K179M была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга (рис. 6d). В целом эти результаты показывают, что усиление PEDV-белком N эффекта повышения трансляции вируса, осуществляемое Akt1, зависит от его киназной активности.

Белок N вируса PEDV колокализуется с Akt1 и взаимодействует с ним

Поскольку белок N коронавирусов обычно осуществляет свои функции посредством взаимодействия с белками хозяина, мы предположили, что взаимодействие белка N вируса PEDV с Akt1 может являться одним из механизмов, посредством которого Akt1 дополнительно усиливает опосредованную белком N активацию трансляции вируса PEDV. Поэтому мы постарались изучить, взаимодействует ли белок N вируса PEDV с Akt1 и какое влияние это оказывает на регуляцию трансляции. Для этого мы сначала определили, ко-локализуются ли эти два белка в клетке, что является основой для их взаимодействия. Клетки HEK293 и PK15 подвергали котрансфекции плазмидами, экспрессирующими EGFP или EGFP-PEDV N, RFP или RFP-Akt1. Ядра клеток окрашивали DAPI. Субклеточную локализацию белков анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Как показано на рис. 7а и 7б, белок N вируса PEDV локализуется преимущественно в цитоплазме, что согласуется с данными литературы. Akt1 локализуется в цитоплазме и ядре. Что ещё более важно, на объединенных изображениях можно обнаружить коллокацию PEDV N и Akt1, что свидетельствует о наличии коллокации этих двух белков.
Далее мы провели эксперимент GST-pull-down для подтверждения взаимодействия белков. Клетки HEK293 подвергали котрансфекции плазмидами, экспрессирующими белок N вируса PEDV и GST-Akt1 или GST (в качестве контроля). Белок N вируса PEDV присутствовал в комплексах, выделенных с помощью GST-Akt1 pull-down, но отсутствовал в комплексах, выделенных с помощью GST pull-down, что свидетельствует о наличии взаимодействия между белком N вируса PEDV и Akt1 (рис. 7c).

Тест на комплементарность с помощью расщепления люминеза (SLCA) является надежным методом изучения белок-белковых взаимодействий. Поскольку было доказано, что белки N вируса PEDV способны связываться друг с другом, мы попытались использовать SLCA для определения взаимодействий белков N вируса PEDV с целью проверки данного метода. Мы создали два конструкта, содержащих кодирующую последовательность белка N вируса PEDV с флаг-тегром, слиянные соответственно с амино-концевым фрагментом (аминокислоты 1–229, LN-PEDV N) или карбокси-концевым фрагментом (аминокислоты 230–311, LC-PEDV N) гена морской люминеза (rLuc) (рис. 8а). По сравнению с контрольной группой при совместной трансфекции плазмид, экспрессирующих LN-PEDV N и LC-PEDV N, были обнаружены значительно более высокие уровни rLuc (рис. 8б). Эти результаты подтверждают, что белки PEDV N могут взаимодействовать друг с другом, что согласуется с данными литературы, и, таким образом, подтверждают достоверность данного метода детектирования. Затем мы поставили цель определить, взаимодействует ли белок PEDV N с Akt1. Чтобы проверить это, мы создали конструкт, содержащий аминокислоты 230–311 rLuc в фьюжн-форме со свиным Akt1 с флаг-меткой, то есть LC-Akt1 (рис. 8а). Клетки HEK293 подвергали котрансфекции плазмидами, экспрессирующими LN-PEDV N и LC-Akt1. Анализ люминофорной активности показал, что в клетках, подвергшихся котрансфекции LN-PEDV N и LC-Akt1, активность rLuc была значительно выше по сравнению с контрольной трансфекцией (рис. 8c). С помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag была подтверждена экспрессия белков LN-PEDV N, LC-PEDV N и LC-Akt1 (рис. 8d). Эти результаты вновь свидетельствуют о наличии взаимодействия между белком PEDV N и Akt1.

Рис. 5. Akt1 усиливает эффект PEDV-белка N по повышению уровня трансляции gRNA.** (a) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими белок N с флаг-меткой, подтип Akt с Myc-меткой, репортерный ген nLuc для трансляции gRNA, а также репортерный ген pGL4.10 fLuc. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминофорной активности. (b) Экспрессия белка N вируса PEDV и подтипа Akt подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag (против Flag-N) или против Myc (против Myc-Akt). (c) Проводили котрансфекцию клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими N-белок PEDV с Flag-меткой, Akt1 с Myc-меткой и Akt1-специфический shRNA, а также gRNA, кодирующий репортерный ген nLuc, и репортерный ген pGL4.10 fLuc. В качестве контроля использовали плазмиду-носитель. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминофорной активности. * — если \(P<0,05\); ** — если \(P<0,01\); **** — если \(P<0,0001\); ns — не значимо. (d) Уровень Akt1 подтверждается с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Myc. Уровень β-актина определяется с помощью антител против β-актина.

Рис. 6. Киназная активность Akt1 необходима для усиления регуляции в сторону повышения трансляции белка N вируса PEDV.** (a) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими белок N вируса PEDV с флаговым тегом, GST с Myc-тегом, слиянным с различными доменами Akt1, репортерный ген nLuc, транслируемый gRNA, и репортерный ген pGL4.10 fLuc. (c) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими N-белок PEDV с флаговым тегом, GST с Myc-тегом, слиянным с различными доменами Akt1, репортерный ген nLuc, транслируемый gRNA, и репортерный ген pGL4.10 fLuc. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминеза. * — если \(P < 0,05\); ** — если \(P < 0,01\); **** — если \(P < 0,0001\); ns — не значимо. (b и d) Экспрессия белков подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием соответствующих антител.

Домен NTD + линкер белка N PEDV снижает взаимодействие с Akt1, но способствует усилению Akt1 в процессе трансляции PEDV

Чтобы определить домен белка N PEDV, опосредующий взаимодействие с Akt1, мы создали несколько конструкций, кодирующих определенные домены белка N в слиянии с LN (рис. 9а). После совместной трансфекции этих конструкций с плазмидой LC-Akt1 наши результаты показали, что по сравнению с полноразмерным N-белком только область NTD + линкер значительно снижала активность rLuc (рис. 9b), что свидетельствует о значительном уменьшении взаимодействия области NTD + линкер с Akt1. Экспрессия фузионных белков с доменами N-белка и LN была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против флага (рис. 9c).

Чтобы определить, играет ли взаимодействие PEDV N-Akt1 роль в регуляции трансляции, мы провели котрансфекцию плазмид, экспрессирующих различные домены белка Akt1 и N-белка PEDV, с репортерным геном трансляции. Интересно, что по сравнению с полноразмерным N-белком домен NTD + линкер приводил к значительному увеличению трансляции, в то время как другие домены не демонстрировали значимых различий (рис. 9d). Эти результаты показывают, что усиливающее действие Akt1 на опосредованную белком N PEDV активацию трансляции не требует взаимодействия между этими двумя белками. Экспрессия белков была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга (рис. 9e).

Обсуждение
Роль белка N вируса PEDV в репликации вируса и образовании нуклеокапсида была достаточно хорошо подтверждена. Однако его участие в трансляции РНК до сих пор изучено недостаточно. Кроме того, информации о влиянии Akt на трансляцию PEDV пока нет. В данном исследовании мы приводим доказательства того, что белок N вируса PEDV усиливает трансляцию РНК, а Akt1 дополнительно усиливает этот эффект.
Сначала мы продемонстрировали, что белок N вируса PEDV усиливает трансляцию вирусной гРНК (рис. 2a–d). Последующие эксперименты по локализации доменов показали, что домен NTD + Linker играет основную роль в усилении трансляции РНК (рис. 3b). Потенциальный молекулярный механизм, лежащий в основе усиления вирусной трансляции доменом NTD + Linker, пока неясен. Было доказано, что как NTD, так и Linker участвуют в вирусных процессах. Известно, что NTD участвует в связывании с РНК, тогда как область Linker обычно опосредует клеточную сигнальную передачу в других функциях. Еще одним интересным наблюдением является то, что экспрессия CTD и CTD + C-arm приводит к подавлению вирусной трансляции (рис. 3b). Имеются убедительные доказательства того, что стресс-частицы могут ингибировать трансляцию белков. Хотя N-белок коронавируса способен подавлять образование стресс-частиц, домен CTD не обладает этой способностью. Таким образом, в будущих исследованиях следует изучить, является ли образование стресс-частиц в присутствии домена CTD причиной ингибирования трансляции.

Поскольку 5′-UTR и 3′-UTR вируса PEDV являются высокоструктурированными и играют важную роль в жизненном цикле вируса, нас интересовало изучение их влияния на регуляцию трансляции PEDV белком N. С этой целью мы создали два репортерных гена, лишенных соответственно 5′-UTR или 3′-UTR. Удивительно, но при наличии только 3′-UTR степень усиления трансляции РНК под действием N-белка PEDV была выше, чем при одновременном наличии обоих UTR (рис. 4b), что указывает на то, что 5′-UTR, возможно, содержит ингибирующие последовательности. Исследования показывают, что область SL-1 5′-UTR SARS-CoV-2 играет активную роль в уклонении от ингибирования трансляции клеточных белков, опосредованного Nsp1. Таким образом, мы предположили, что область SL-1 5′-UTR PEDV играет аналогичную роль в регуляции трансляции PEDV белком N. Действительно, при наличии только последовательности SL-1 мы наблюдали значительное усиление эффекта белка N по повышению трансляции (рис. 4e). Кроме того, мы исследовали роль отдельных участков 3′-UTR в регуляции трансляции белком N и обнаружили, что BSL необходим для регуляции трансляции вирусной РНК белком N PEDV (рис. 4h). Поскольку роль BSL в жизненном цикле PEDV до сих пор неясна (Tsai et al., 2018), наши результаты дают некоторые подсказки относительно его функции. Роль Akt в жизненном цикле коронавирусов также остаётся неясной. В данном исследовании мы обнаружили, что Akt1 может ещё больше усиливать положительное влияние белка N на трансляцию вирусной РНК за счёт своей киназной активности (рис. 5 и 6). Имеются убедительные доказательства того, что функции белка N PEDV регулируются посредством взаимодействия с белками хозяина. В соответствии с этой точкой зрения мы продемонстрировали в эксперименте GST-pull-down наличие взаимодействия между этими двумя белками при их экзогенной экспрессии (рис. 7c). Наши попытки подтвердить взаимодействие между эндогенным Akt и белком N PEDV в клетках свиней не увенчались успехом, что, вероятно, связано с отсутствием антител, обладающих высокой аффинностью и специфичностью к свиному Akt (данные не показаны). Локализация доменов показала, что домен NTD + Linker больше не взаимодействует с Akt1 (рис. 9b). При изучении влияния белковых взаимодействий на трансляцию вирусной РНК, к нашему некоторому удивлению, в присутствии Akt1 домен NTD + Linker продемонстрировал более сильный эффект усиления по сравнению с полноразмерным белком и другими доменами белка N PEDV (рис. 9d). Соответствующий молекулярный механизм в настоящее время остаётся неясным. Однако мы предполагаем, что это может быть, по крайней мере частично, связано с тем, что Akt1, возможно, влияет на фосфорилирование белка N PEDV. Фосфорилирование играет важную роль в регуляции функций белка N, таких как связывание вирусной РНК, синтез gRNA и sgRNA, сборка вирусных частиц, сигнальная трансдукция в клетках-хозяевах и регуляция иммунного ответа хозяина. В Ser/Arg-обогащенном мотиве в области линкера было идентифицировано несколько высококонсервативных остатков сериновой и треониновой кислот, которые являются кластерами фосфорилирования, причем основной киназой в этом процессе является гликогенкиназа-3 (GSK-3). Активность GSK-3 регулируется Akt. Таким образом, вполне обосновано предположить, что Akt может изменять уровень фосфорилирования белка N PEDV. Будущие исследования должны быть направлены на изучение влияния фосфорилирования белка N PEDV на регуляцию трансляции вируса.

Рис. 7. Колокализация и взаимодействие белка N вируса PEDV с Akt1.** (a и b) Колокализация белка N вируса PEDV с Akt1. Клетки HEK293 (a) или PK-15 (b) в камерных предметных стеклах подвергали котрансфекции плазмидами, экспрессирующими EGFP с флагом или EGFP-N, а также RFP с Myc-меткой или RFP-Akt1. Через 48 часов ядра клеток окрашивали DAPI. Клетки наблюдали с помощью конфокального микроскопа. Скомбинированные изображения демонстрируют коллокацию белка N вируса PEDV и Akt1. (c) Эксперимент GST-pull-down. Клетки HEK293 подвергали котрансфекции плазмидами, экспрессирующими белок N PEDV, GST с Myc-меткой или GST-Akt1. Через 48 часов после трансфекции проводили эксперимент GST-pull-down с клеточными лизатами. Анализ входного материала и продуктов pull-down осуществляли методом вестерн-блоттинга с использованием антител против белка N PEDV и Myc соответственно.

Таким образом, наше исследование доказало, что белок N вируса PEDV усиливает трансляцию PEDV, причем основную роль в этом играет домен NTD + Linker. Кроме того, мы обнаружили, что структурные элементы в 5′- и 3′-UTR по-разному участвуют в усилении трансляции белком N. Кроме того, Akt1 усиливает этот эффект посредством киназной активности своего центрального каталитического домена. Несмотря на то что Akt1 и N-белок PEDV связываются друг с другом, это взаимодействие не является обязательным для регуляции трансляции. Данное исследование углубило наше понимание функциональной роли N-белка в биологии коронавирусов.

Рис. 8. Взаимодействие белка N вируса PEDV с Akt1 в тесте комплементарности расщепления флуорелазы (SLCA). ** (a) Схематическое изображение конструкций, использованных в SLCA. (b и c) Совместная трансфекция клеток HEK293 LN-PEDV N и LC-PEDV N или пустым вектором (b), LC-Akt1 и LN-PEDV N или пустым вектором (c). Через 48 часов после трансфекции проводился тест на люминеза. *, если \(P<0,05\); ***, если \(P<0,001\); _ns_, не значимо. (d) Экспрессия белков подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием соответствующих антител.

Рис. 9: Взаимодействие N-домена PEDV и Akt1 не является необходимым условием для усиления трансляции.** (a) Схематическое изображение SLCA-конструкций, экспрессирующих различные домены белка N PEDV (синий цвет). Отсутствующие домены обозначены серым цветом. (b) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами LC-Akt1, различными плазмидами с доменами N LN-PEDV или контрольным вектором. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминеза. (c) Подтверждение экспрессии различных слитных белков доменов LN-PEDV N с помощью вестерн-блоттинга. (d) Совместная трансфекция клеток HEK293 плазмидами, экспрессирующими Akt1 с Myc-меткой и домены PEDV N с Flag-меткой, а также gRNA, кодирующим репортерный ген nLuc, и pGL4.10, кодирующим репортерный ген fLuc. Через 48 часов после трансфекции проводили анализ люминезанта. * — если \(P<0,05\); ns — не значимо. (e) Подтверждение экспрессии белка N-домена PEDV с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Flag.