[Углубленное изучение литературы] Первый в Китае кандидат в вакцины против синего уха из линейки L1 — штамм SD-R: полный анализ безопасности и перекрестной защиты 

В настоящее время динамика распространения синдрома репродуктивных и респираторных расстройств свиней (PRRS, далее — «синдром голухого уха у свиней») в нашей стране претерпела коренные изменения. Судя по результатам генотипирования гена ORF5, штаммы линии L1, представленные типами NADC30 (L1.8) и NADC34 (L1.5), стали абсолютно доминирующими эпидемическими штаммами на территории всей страны. Однако большинство имеющихся в Китае коммерческих аттенуированных вакцин созданы на основе штаммов линии L8 (таких как JXA1-R, HUN4-F112, TJF-F92, GDr180, штамм PC) или на линии L5 (например, VR2332, штамм R98), что обусловлено значительным генетическим разрывом и низкой геномной гомологией (обычно ниже 85 %) по сравнению со штаммами линии L1, что приводит к врождённому недостатку перекрёстной защиты. В связи с этим разработка специальной аттенуированной вакцины, направленной против линии L1, стала насущной потребностью отрасли. Согласно открытым источникам, ряд научно-исследовательских институтов в Китае уже ведут исследования по созданию вакцины против синдрома голубых ушей свиней линейки L1. В частности, Харбинский институт ветеринарии успешно разработал первый в Китае кандидат-штамм аттенуированной живой вакцины линейки L1 — штамм SD-R, который на данный момент является единственным кандидат-штаммом вакцины линейки L1, прошедшим систематическую оценку перекрестной защиты.

1. Информация о штамме SD-R

Кандидат в вакцины SD-R представляет собой аттенуированный живой вакцинный кандидат, полученный на основе исходного штамма PRRSV SD (L1.8, NADC30-like/L1C), сходного с NADC30, выделенного в 2016 году в провинции Шаньдун, путем 125 последовательных пассажей вируса в клетках Marc-145. После 125 пассажей штамм SD-R по сравнению с исходным штаммом приобрел в общей сложности 75 нуклеотидных изменений, из которых 31 представляют собой миссенс-мутации, приводящие к замене аминокислот; мутации в основном сосредоточены в областях Nsp2 и вторичных структурных белков GP2-4, при этом в 5′-UTR и 3′-UTR имеется по 2 стабильных нуклеотидных мутации. Результаты анализа генетической стабильности показали, что с 100-го по 150-е поколение общее количество аминокислотных мутаций по всему геному стабильно оставалось на уровне 31, новых нуклеотидных или аминокислотных изменений не наблюдалось, что свидетельствует о полной адаптации штамма SD-R к клеткам Marc-145 и достижении им генетической стабильности, что делает его пригодным в качестве кандидата в вакцины.

2. Оценка безопасности штамма SD-R

Результаты ряда испытаний на безопасность показывают, что штамм SD-R обладает высокой клинической безопасностью, что конкретно проявляется следующим образом:
2.1 Отсутствие клинических реакций: после вакцинации 28-дневных поросят, отрицательных как по антигенам, так и по антителам, высокими дозами (2×10⁶,0 TCID₅₀) или методом повторной вакцинации одной дозой в течение 28-дневного периода наблюдения у всех вакцинированных поросят не наблюдалось никаких клинических симптомов, связанных с PRRS, таких как лихорадка, анорексия, кашель и т. д., что соответствует состоянию поросят из контрольной группы.

2.2 Вирусемия была кратковременной и низкоинтенсивной: через 7 и 14 дней после иммунизации в группе с высокой дозой низкий уровень копий вируса был обнаружен лишь в крови небольшого числа свиней (результаты анализа через 7 дней: 0/5, 2/5, 1/5; через 14 дней: 0/5, 1/5, 0/5), причем вирусемия быстро исчезла самопроизвольно. В группе с однократной вакцинацией через 7 дней после иммунизации положительный результат на патоген был получен лишь у небольшого числа свиней (1/5, 0/5, 0/5), а через 14 дней вирусная нуклеиновая кислота в крови уже не обнаруживалась; вирусгемия также не наблюдалась после ревакцинации. Продолжительность вирусгемии была значительно короче, чем при применении вакцины против высокопатогенного PRRSV (HP-PRRSV), и сопоставима с вакциной против классического PRRSV CH-1R.
2.3 Низкая вирусная нагрузка в тканях: через 14 дней после иммунизации поросят усыпили и провели вскрытие; низкий уровень копий вируса был обнаружен лишь в небольшом количестве тканей, таких как легкие, миндалины и лимфатические узлы, причем вирусная нагрузка в тканях была крайне низкой.
2.4 Отсутствие влияния на показатели роста: среднесуточный прирост веса поросят из группы иммунизации не отличался значимо от показателей контрольной группы, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния данной вакцины на нормальный рост и развитие свиней.
2.5 Низкий риск восстановления вирулентности: исходный штамм SD, использованный для аттенуации, обладает вирулентностью среднего уровня, что значительно ниже, чем у HP-PRRSV или вируса PRRSV, сходного с высокопатогенным (HP-like PRRSV), что снижает потенциальный риск восстановления вирулентности на генетическом уровне.
Таким образом, безопасность штамма SD-R не уступает классическим аттенуированным вакцинным штаммам, таким как CH-1R и VR2332.

3. Эффективность иммунной защиты при заражении

Эксперимент 1: Защита от штамма L1.8 (типа NADC30) того же генеалогического ряда — полная клиническая защита (5 из 5)
Поросята 4-недельного возраста получили однократную вакцинацию штаммом SD-R (доза вакцины — 2×10⁵,0 TCID₅₀ на голову), через 28 дней после иммунизации подвергали заражению соответственно гомологичным штаммом SD средней вирулентности и гетерологичным штаммом WK108 (оба штамма относятся к типу NADC30); одному и тому же поросенку штамм вводили двумя путями: внутримышечно и интраназально (доза заражения составляла 4×10⁵,0 TCID₅₀/голова), после чего проводили наблюдение в течение 21 дня. Результаты вскрытия показали: во всех группах заражения наблюдались клинические симптомы различной степени выраженности, такие как лихорадка, снижение аппетита (снижение суточного прироста веса) и кашель, тогда как в группе с иммунизацией и заражением не наблюдалось никаких аномальных клинических симптомов (клиническая эффективность защиты составила 5/5); после заражения вирусная нагрузка в крови животных из иммунизированной группы была значительно ниже, чем в контрольной группе (снижение составило более чем в 1000 раз), при этом вирусная нагрузка в тканях также значительно снизилась; при вскрытии в легких контрольной группы были обнаружены типичные патологические изменения, такие как пластинчатые уплотнения и кровоизлияния в лимфатических узлах, тогда как в иммунизированной группе заметных патологических изменений не наблюдалось.

Испытание 2: Защита от гетерогенного штамма L1.5 (подобного NADC34) — хорошая клиническая защита (5 из 5)
5-недельным поросятам была проведена однократная вакцинация штаммом SD-R (доза вакцины — 2×10⁶,² TCID₅₀ на голову), через 28 дней после иммунизации подверглись заражению штаммом TZJ1341-2012 (штамм типа NADC34); заражение проводилось одновременно путем внутримышечной инъекции и интраназального введения одному и тому же поросенку (доза заражения составляла 4×10⁵,0 TCID₅₀/голова); после заражения проводилось 21-дневное наблюдение с последующим вскрытием.
У части свиней из контрольной группы после заражения наблюдались потеря аппетита, сонливость, кашель и преходящая лихорадка; в группе с иммунизацией и заражением никаких клинических симптомов не наблюдалось. Через 7–14 дней после заражения вирусная нагрузка в крови свиней из иммунизированной группы была значительно ниже, чем в контрольной группе, а количество вирусоносителей в крови и тканях было меньше, чем в контрольной группе. В иммунизированной группе не наблюдалось макроскопических или гистопатологических изменений; в контрольной группе заражения в легких и подчелюстных лимфатических узлах появились типичные для PRRS поражения.

Испытание 3: Защита от штамма L1A — хорошая клиническая защита (5/5)
Штамм TZJ2756 представляет собой штамм L1A — рекомбинантный штамм, созданный на основе каркаса, сходного с NADC30, причем его каркас соответствует NADC30, а ген GP5 получен от NADC34.
4-недельным поросятам была проведена однократная вакцинация штаммом SD-R (доза вакцины составляла 2×10⁶,² TCID₅₀/голова), через 28 дней после иммунизации подвергались заражению штаммом TZJ2756: заражение проводилось одновременно путем внутримышечной инъекции и интраназального введения одному и тому же поросенку (доза заражения составляла 4×10⁵,0 TCID₅₀/голова); после заражения проводилось наблюдение в течение 21 дня (21 дпз) с последующим вскрытием.
В группе иммунизации не наблюдалось никаких клинических симптомов; в контрольной группе с вирусоинфекцией отмечались постоянная лихорадка (3–10 dpi), кашель, анорексия и сонливость. Суточный прирост массы тела в иммунизированной группе был значительно выше, чем в контрольной группе с заражением, и не отличался значимо от показателей в группе слепого контроля. Уровень вирусгемии в иммунизированной группе в период с 5 по 21 дпз значительно снизился и к 21 дпз снизился до нуля. В иммунизированной группе не было обнаружено выраженных патологических повреждений; в контрольной группе с заражением у 3 из 5 свиней наблюдались инфильтраты в лёгких и кровоизлияния в лимфатических узлах.

Испытание 4: Защита от заражения гетерогенным вирусом L8.7 (штамм HuN4) — клиническая эффективность 80 %, выживаемость 100 %
4-недельные поросята получили однократную вакцинацию штаммом SD-R (доза вакцины — 2×10⁶,0 TCID₅₀/голова), через 28 дней после иммунизации подвергались заражению высокопатогенным вирусом синего уха свиней штамма HuN4. Заражение проводили одновременно путем внутримышечной инъекции и интраназального введения (доза заражения составляла 4×10⁵,0 TCID₅₀/голова). После заражения проводили наблюдение в течение 21 дня (21 дпз) и вскрытие.
Выживаемость в группе иммунизации с заражением составила 100 % (5/5); летальность в контрольной группе заражения составила 40 % (2/5). В группе иммунизации лишь у одного поросенка наблюдался лёгкий кашель, тогда как у всех свиней в контрольной группе заражения развились такие тяжёлые симптомы, как высокая температура (≥41,0 °C), угнетённое состояние и анорексия. Суточный прирост массы тела в группе иммунизации значительно улучшился и не отличался от показателей группы нулевого контроля. В группе с иммунизацией не наблюдалось атрофии вилочковой железы, а патологические повреждения легких были значительно менее выраженными; в контрольной группе с заражением наблюдались тяжелая атрофия вилочковой железы и инфильтраты в легких. Результаты показывают, что штамм SD-R обеспечивает хороший клинический защитный эффект против гетерогенного высокопатогенного вируса синего уха свиней (штамм HuN4), при этом клиническая защита составила 80 %, а выживаемость — 100 %.

Испытание 5: Защита от заражения гетерогенным штаммом L8.7.5 (штамм DLF) — хорошая клиническая защита
В результате эволюции, продолжавшейся почти двадцать лет, высокопатогенный вирус синего уха свиней (HP-PRRSV) претерпел значительные генетические изменения и эволюционировал в высокопатогенный вирус, сходный с PRRSV (HP-like PRRSV), который также обладает высокой патогенностью. Штамм DLF относится к штаммам L8.7.5 (HP-like PRRSV); его полногеномная нуклеотидная схожесть со штаммом SD-R составляет 83,3 %, что позволяет отнести его к категории гетерогенных штаммов; при заражении этим штаммом 4-недельных поросят летальность достигает 40 % (2 из 5).
4-недельные поросята прошли однократную вакцинацию штаммом SD-R (вакцинационная доза составляла 2×10⁶,0 TCID₅₀/голова); через 28 дней после вакцинации проводилось заражение штаммом DLF, причем заражение осуществлялось одновременно путем внутримышечной инъекции и интраназального введения одному и тому же поросенку (доза заражения составляла 4×10⁵,0 TCID₅₀/голова); после заражения проводилось наблюдение в течение 21 дня (21 дпз), после чего проводился вскрытие.
Все поросята как в группе иммунизации, так и в контрольной группе с заражением выжили (в независимых испытаниях на патогенность летальность при заражении штаммом DLF может достигать 40%; в данном испытании на защиту летальных исходов не наблюдалось, поскольку на момент заражения поросята достигли 8-недельного возраста и их сопротивляемость была повышена). Что касается летальности, то в группе иммунизации с заражением она составила 0%, а в контрольной группе с заражением — 40%. В группе с иммунизацией и заражением лишь у 2 из 5 поросят наблюдалась преходящая лихорадка (на 1-й и 5-й день после заражения соответственно), других типичных симптомов PRRS не отмечалось; у всех поросят контрольной группы с заражением наблюдалась стойкая высокая температура (продолжительностью 2–6 дней, температура тела ≥40,5 °C), сопровождавшаяся сонливостью, кашлем, снижением аппетита и другими симптомами. Суточный прирост массы тела в группе с иммунизацией после заражения не отличался значимо от показателей группы «пустого» контроля и был значительно выше, чем в контрольной группе с заражением; в контрольной группе с заражением суточный прирост массы тела значительно снизился, особенно в период с 1 по 7-й день и с 8-го по 14-й день после заражения. В группе иммунизации не наблюдалось атрофии вилочковой железы, легочные поражения были крайне незначительными и при визуальном осмотре не отличались от таковых в группе пустого контроля; в группе контрольной инфицированности у 3 из 5 поросят наблюдалась атрофия вилочковой железы, а также тяжелая интерстициальная пневмония с уплотнением легких. В группе иммунизации уровень вирусемии значительно снизился через 5–10 дней после заражения, а через 21 день вирусная нагрузка стала неопределяемой; вирусная нагрузка в различных тканях, таких как сердце, печень, селезенка, легкие, почки и лимфатические узлы, была значительно ниже, чем в контрольной группе с заражением. Вышеуказанные результаты показывают, что штамм SD-R способен обеспечить широкую перекрестную защиту против штаммов PRRSV, сходных с HP.

4. Исследование механизмов перекрестной защиты. Исследовательская группа Харбинского ветеринарного института продолжила изучение механизмов формирования широкого спектра перекрестной защиты, вызываемой штаммом SD-R, сосредоточив внимание на области клеточного иммунитета:
4.1 Ограничения гуморального иммунитета (нейтрализующих антител)
Сыворотка поросят, иммунизированных штаммом SD-R, способна продуцировать нейтрализующие антитела с высоким титром против гомологичных штаммов (таких как сам штамм SD-R). Однако через 28 дней после иммунизации (до заражения вирусом) нейтрализующая активность сыворотки в отношении различных гетерогенных штаммов, таких как HuN4, DLF, LNTZJ1341-2012, в целом была низкой или не поддавалась определению. Это указывает на то, что ранняя защита, возможно, не зависит в основном от перекрестных нейтрализующих антител. Только после заражения вирусом (через 21 день после заражения) титр гетерогенных нейтрализующих антител повышается, и это изменение способствует элиминации вируса на поздних стадиях.
4.2 Ключевая роль клеточного иммунитета
Широкоспектральный Т-клеточный ответ: при in vitro стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) иммунизированных поросят штаммом SD-R с использованием штаммов PRRSV различных подтипов, таких как L1.8, L1.5, L8.7, результаты показали, что их Т-клетки демонстрировали значительную пролиферативную реакцию (коэффициент пролиферации 6,25–18,2 %), в то время как Т-клеточный ответ, индуцированный другими вакцинными штаммами, такими как CH-1R и HuN4-F112, был относительно узким.
Раннее выделение IFN-γ: уже на 14-й день после вакцинации (14dpv) у свиней, иммунизированных штаммом SD-R, после стимуляции различными штаммами значительно увеличилось количество Т-клеток, секретирующих IFN-γ, причем этот IFN-γ в основном секретировался эффекторными Т-клетками (включая CD3+CD4+ Th-клетки и CD3+CD8+ CTL-клетки).
В исследовании делается вывод, что штамм SD-R способен индуцировать у свиней широкий спектр ранних Т-клеточных иммунных ответов (особенно ответов IFN-γ), что является важным механизмом, обеспечивающим перекрестную защиту от множества штаммов PRRSV различных линий и подтипов.

5. Выводы и перспективы. Разработанный командой Харбинского ветеринарного научно-исследовательского института кандидатный вакцинный штамм SD-R представляет собой безопасную аттрактивную живую аттенуированную вакцину против вируса PRRSV линейки L1 с широким спектром действия. Эта вакцина обладает высокой безопасностью, не вызывает клинических реакций после иммунизации и не влияет на показатели роста свиней. Что касается защитной эффективности, она не только обеспечивает полную защиту от заражения гомологичными штаммами, но и защищает от циркулирующих в настоящее время в Китае штаммов NADC30-like (L1.8), NADC34-like (L1.5), HP-PRRSV (L8.7), а также от вновь появившихся гетерогенных высокопатогенных штаммов, таких как HP-подобный (L8.7.5) и L1A (рекомбинантный штамм на основе каркаса NADC30-подобного), обеспечивая значительное снижение заболеваемости, смертности, патологических повреждений и уровня вирусемии. Механизм перекрестной защиты в основном обусловлен индуцированным широким спектром Т-клеточного иммунного ответа, а не ранними нейтрализующими антителами.
Разработка штамма SD-R восполнила пробел в Китае в области вакцин против синдрома голубых ушей линейки L1 и предоставила чрезвычайно перспективный инструмент для борьбы с текущей сложной эпидемической ситуацией. В будущем дальнейшая клиническая валидация и промышленное внедрение этой вакцины, как ожидается, позволят коренным образом решить проблему недостаточной защиты традиционных вакцин от штаммов линейки L1.