Эволюция вируса птичьего энцефалита и спинномозгового воспаления в процессе адаптации к куриным эмбрионам 

Делюсь статьёй, опубликованной в журнале «Ветеринарная микробиология» под названием «Эволюция вируса птичьего энцефаломиелита в процессе адаптации к эмбрионам»

Резюме Вирус птичьего энцефалита и спинномозгистого воспаления (AEV) дикого типа при пероральном или подкожном заражении вызывает неврологические симптомы у цыплят, но не оказывает патогенного воздействия на молодых кур. Однако если вирус адаптируется к куриным эмбрионам посредством последовательного пассажа в них, то после подкожного заражения он может вызывать птичий энцефалит и спинномозговое воспаление (AE) у птиц любого возраста. Недавно появились сообщения о нескольких случаях птичьего энцефалита-миелита у молодняка яичных кур вскоре после внутрикожной вакцинации. Целью данного исследования было установить, были ли эти вспышки вызваны случайной адаптацией вакцины к куриным эмбрионам.
В ходе исследования были выделены вирусы из двух вакцин и одного полевого образца. Одна из вакцин применялась в одном из стад до начала вспышки. После первого поколения куриных эмбрионов, независимо от типа вакцины, паралича у эмбрионов не наблюдалось, что указывает на отсутствие адаптации к куриным эмбрионам как у вакцин, так и у полевых штаммов. К 7-му поколению все три штамма полностью адаптировались к куриным эмбрионам и могли вызывать у них типичные патологические изменения. Вирусная нагрузка, определённая с помощью количественной флуоресцентной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR), оставалась стабильной в процессе пассажа.
Частичные последовательности гена VP2 вакцины, полевых образцов и ещё четырёх полевых штаммов практически полностью совпадали и были высоко сходны с опубликованными во всём мире последовательностями; заметные различия наблюдались только в последовательностях, полученных от невакцинированных кур. Анализ всего генома выявил 2 однонуклеотидных полиморфизма (SNP), позволяющих различать дикие штаммы и штаммы, адаптированные к куриным эмбрионам. Секвенирование по методу Сэнгера мозговой и нервной ткани пяти полевых штаммов, а также штаммов 1-го, 3-го и 5-го поколений показало, что мутации, указывающие на адаптацию к куриным эмбрионам, впервые появились в 5-м поколении.

1
Введение
Птичий энцефаломиелит (AE) вызывается одноимённым вирусом (AEV), который является единственным представителем рода Tremovirus семейства малых РНК-вирусов. После заражения восприимчивых цыплят вертикальным или горизонтальным путём (перорально или подкожно) у них появляются неврологические симптомы, характеризующиеся тремором, атаксией, а также затруднениями при ходьбе, вызванными прогрессирующей слабостью или параличом ног. Если больные цыплята не могут добыть корм и воду, они могут погибнуть. У несушек после заражения пероральным или подкожным путем наблюдается кратковременное снижение яйценоскости. Поэтому несушек широко вакцинируют. Племенных птиц также необходимо вакцинировать для передачи материнских антител, чтобы защитить цыплят от заражения в период их восприимчивости.
Штамм вакцины соответствует полевому штамму и вводится курам-несушкам и племенным курам в возрасте от 10 до 16 недель перорально или подкожно в крыло. У птиц этого возраста после заражения клинические проявления болезни не наблюдаются, однако выработка стойкого иммунитета индуцируется. Такой иммунитет не только защищает кур в период яйценоскости, но и обеспечивает защиту потомства за счёт материнских антител. Если вирус проходит слишком много поколений в куриных эмбрионах (например, в процессе производства вакцины), может произойти адаптация вируса к куриным эмбрионам. Штаммы вируса птичьего энцефалита-миелита, адаптированные к куриным эмбрионам, становятся нейротропными и теряют способность инфицировать птиц при пероральном заражении, однако после подкожного введения могут вызывать клинические проявления заболевания у птиц любого возраста. Полевые штаммы не вызывают патологических изменений в куриных эмбрионах, тогда как адаптированные к эмбрионам штаммы приводят к параличу и задержке развития эмбрионов.
Недавно появились сообщения о нескольких случаях птичьего энцефалита-миелита у молодых несушек в возрасте от 11 до 14 недель после инактивированной вакцинации через крыловую мембрану. Возможные причины этих нетипичных инфекций включают: слишком большое количество пассажей используемой вакцины, приведшее к адаптации к куриным эмбрионам; иммуносупрессию у кур; а также возможное ошибочное введение вакцины внутримышечно, что привело к появлению неврологических симптомов у кур любого возраста.
Целью данного исследования было изучение первой возможности, а именно адаптации используемой вакцины к куриным эмбрионам. Кроме того, в рамках исследования было проведено секвенирование штаммов вируса птичьего энцефалита-спинномозгиста дикого типа и адаптированного к куриным эмбрионам с целью выявления мутаций, связанных с этой адаптацией.

2
Материалы и методы 2.1 Вакцины и образцы В рамках данного исследования были исследованы две живые вакцины: вакцина A (компания «Интервей»), которая применялась в одном из стад кур до вспышки заболевания; вакцина B (компания «Мерия»), применявшаяся в стаде молодых кур, в котором не наблюдалось случаев птичьего энцефалита-миелита. Обе вакцины представляли собой комбинированные вакцины против птичьего энцефалита-миелита и оспы птиц, вводимые путем интракриловой инъекции. Было отобрано 6 образцов мозговой или нервной ткани из 5 случаев птичьего энцефалита-миелита в штате Калифорния, обозначенных как «полевой A»–«полевой E». Эти случаи включали 3 вспышки, подробно описанные Сентиесом-Квеем и др.

2.2 Выделение и культивирование штаммов вируса птичьего энцефаломиелита. При выделении штаммов A и B вакцины отбирают 50 мкл вакцины и разбавляют 5 мл антибиотико- / противогрибковым раствором (пептидо-фосфатный бульон TPB) (пенициллин 10 000 единиц/мл, стрептомицин 10 мг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл, 100-кратный концентрат). После добавления 250 мкл хлороформа смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, периодически перемешивая, для инактивации вирусов птичьей оспы, содержащихся в обеих вакцинах. Затем образец центрифугируют при 100×g в течение 5 минут, после чего верхнюю водную фазу используют для инокуляции куриных эмбрионов.
При выделении вируса из образца мозговой ткани (полевый образец A) ткань подвергают 3-кратному циклу замораживания-размораживания и механически измельчают в пластиковом пакете. Около 1 мл измельченного материала разбавляют 4 мл трипсино-фосфатного бульона с антибиотиками и противогрибковыми препаратами, обрабатывают ультразвуком, а затем стерильно фильтруют через шприцевой фильтр 45 мкм.
0,1 мл вирусной суспензии или трипсино-фосфатного бульона вводили в желточный мешок куриных эмбрионов в возрасте 6–7 дней, свободных от специфических патогенов. В каждую группу (вакцина A, вакцина B и полевая проба A) инокулировали по 25–30 куриных эмбрионов. Эмбрионы, погибшие в течение 24 часов после инокуляции, относили к неспецифической смертности. Начиная с 24-го часа ежедневно проводили просвечивание яиц для выявления специфической смертности эмбрионов. Когда эмбрионы достигали 19-дневного возраста, их вскрывали для осмотра. Наблюдают за активностью или параличом каждого куриного зародыша; после удаления прилипших остатков яичной оболочки и желточного мешка зародыши взвешивают по отдельности.
Из каждой группы штаммов отбирают по 5–6 целых головок куриных зародышей, смешивают их, добавляют примерно равный объем трипсино-фосфатного бульона, содержащего антибиотик/противогрибковый раствор, гомогенизируют и обрабатывают ультразвуком. Смесь центрифугируют при 20 000 × g и 4 °C в течение 10 минут, удаляют осадок. Супернатант после стерильной фильтрации используют для следующего поколения культивирования; в каждой группе проводится в общей сложности 7 поколений культивирования. На протяжении всего эксперимента устанавливается контрольная группа с имитацией инокуляции.

2.3 Гистопатология. Целые куриные эмбрионы 7-го поколения из всех групп фиксировали 10 %-ным нейтральным формалином; после подготовки тканей их обрабатывали по стандартной методике и заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 микрометров помещали на предметные стекла, окрашивали по стандартной методике гематоксилином-эозином и исследовали под оптическим микроскопом.
2.4 Подготовка РНК для мониторинга вирусной нагрузки и определения частичной последовательности гена VP2. В соответствии с инструкцией к набору РНК извлекали из тканевой суспензии и вакцины с использованием набора RNEasy Small. Для инфицированных куриных эмбрионов использовали суспензию головы, обработанную ультразвуком; для полевых образцов — суспензию мозговой или нервной ткани, неразбавленную трипсиновым фосфатным бульоном. В соответствии с инструкцией к набору, проводить деназификацию РНК, предназначенной для определения вирусной нагрузки, с использованием набора Turbo DNA-free.
2.5 Определение вирусной нагрузки методом количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Для количественного флуоресцентного ПЦР-анализа РНК вируса птичьего энцефалита и β-актина в реальном времени используется набор QuantiNova для ПЦР с зондами (компания Qiagen). В 10 мкл основной реакционной смеси добавляют по 10 пимоль каждой праймерной пары и зонда (табл. 1), 2 мкл матричной РНК, 0,2 мкл ферментной смеси, а затем доливают водой без нуклеаз до общего объема 10 мкл. Протокол амплификации: обратная транскрипция при 45 °C в течение 10 минут, предварительная денатурация при 95 °C в течение 5 минут, затем 45 циклов (денатурация при 95 °C в течение 5 секунд, отжиг и удлинение при 60 °C в течение 1 минуты). Сбор флуоресцентного сигнала осуществлялся после этапа отжига и удлинения. Все образцы анализировались в 3 повторных определениях. Для определения эффективности амплификации образцы подвергались 10-кратному градиентному разведению водой без нуклеаз. Исходные образцы и образцы, разведённые до концентрации 10⁻⁴, анализировались по 3 повторным определениям. С помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.1 методом регрессии рассчитывали количественный цикл (Cq) и эффективность амплификации. На основании среднего количественного цикла и измеренных значений эффективности амплификации β-актина (E_beta-act) и вируса птичьего энцефаломиелита (E_AEV) по формуле рассчитывали относительную вирусную нагрузку вируса птичьего энцефаломиелита по отношению к РНК β-актина.

Таблица 1. Целевые последовательности для определения вирусной нагрузки методом RT-qPCR и секвенирования, целевые области, размеры амплифицированных фрагментов с помощью праймеров и зонды

2.6 Определение частичных последовательностей генов VP2 и VP3 и их сравнение с опубликованными последовательностями с использованием праймеров MK AE1 и MK AE2 (амплификация фрагмента длиной 619 пар оснований в области VP2 гена полипротеина с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции). С помощью праймеров AEseq_For_3 и AEseq_Rev_3 был амплифицирован фрагмент длиной 788 пар оснований из области VP3 гена полипротеина. Продукты ПЦР были очищены с помощью набора QIAquick для очистки продуктов ПЦР, после чего было проведено прямое и обратное секвенирование.
Была выбрана последовательность длиной 539 пар оснований из гена VP2 для филогенетического анализа с использованием программного обеспечения Phylogeny.fr с настройками по умолчанию; для сравнения последовательностей использовалась программа MUSCLE, а для построения филогенетического дерева и расчета вероятностной поддержки ветвей — программа PhyML. Вся информация о последовательностях приведена в таблице 2.

2.7 Полное геномное секвенирование. Была предпринята попытка провести полное геномное секвенирование двух вакцин, гомогената мозговой ткани полевого штамма A и 7-го поколения трех штаммов. Из 100 мкл вакцины или гомогената мозговой ткани выделяли РНК с помощью реагента Trizol, осаждали изопропанолом и ресуспендировали в 30 мкл воды без нуклеаз. ДНК удаляли с помощью набора Turbo DNA-free, после чего рибосомную РНК удаляли с помощью 5′-фосфат-зависимой нуклеазы Terminator в соответствии с инструкцией. Для остановки реакции добавляли этилендиаминтетрауксусную кислоту до конечной концентрации 5 ммоль/л; для оценки уровня загрязнения рибосомной РНК использовали набор QIA Virus RNA (очистка, без добавления РНК-носителя, объем элюата — 30 мкл).
Оцените уровень загрязнения рибосомной РНК с помощью микрочипа для РНК на биоанализаторе 2100. Подготовьте 6 библиотек комплементарной ДНК с помощью набора NEBNext для сверхвысокопроизводительного направленного синтеза РНК-библиотек и проведите двунаправленное секвенирование длиной 100 пар оснований на платформе Illumina HiSeq 3000. Сравнили секвенированные библиотеки с геномом курицы (Galgal-5.0) и удалили чтения, происходящие от хозяина, с помощью программного обеспечения Tophat 2. С помощью алгоритма сборки A5 (Coyle et al., 2015) несравненные чтения были собраны в кластеры перекрывающихся последовательностей, а с помощью программного обеспечения NCBI-BLAST+ были идентифицированы вирусные кластеры, наиболее схожие с известными вирусными генами.
Из полевых образцов было получено всего 3 кластера, общей длиной 1272 пар оснований. Для получения генома полевого штамма A было дополнительно разработано 8 пар праймеров, охватывающих в общей сложности 6042 пары оснований. С использованием этих праймеров, а также пар праймеров MK AE1/MK AE2 и AEseq_For_3/AEseq_Rev_3 было проведено амплификация 10 фрагментов методом обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) и их секвенирование. С помощью программного обеспечения MacVector последовательности были сопоставлены с последовательностями американских штаммов и собраны в геном.

2.8 Анализ всего генома. С помощью программы Clustal Omega полученные последовательности были сопоставлены с последовательностями американского штамма, штамма Ван Рокеля, а также изолятов из Венгрии и Гонконга. Были отобраны аминокислотные последовательности гена VP2 (222 аминокислоты), полного гена VP3 (245 аминокислот), гена полимеразы (486 аминокислот) и гена АТФазы (326 аминокислот), после чего с помощью вышеупомянутого программного обеспечения Phylogeny.fr был проведен филогенетический анализ.
2.9 Статистический анализ. Для сравнения разницы между средней массой куриных эмбрионов и массой эмбрионов контрольной группы использовались однофакторный дисперсионный анализ и тест Деннита для множественных сравнений. Статистический анализ проводился с помощью программы Prism (Графпад, Ла-Хойя, Калифорния, США).

3
Результаты 3.1 Выделение и пассаж штаммов вируса птичьего энцефаломиелита Вирусы были выделены из двух вакцин (A и B) и одного полевого образца (полевой A). Вакцина A применялась в одном из стад кур до вспышки заболевания, а вакцина B (производства другого производителя) — в стаде молодых кур, в котором не наблюдалось случаев птичьего энцефаломиелита. После первого поколения куриные эмбрионы не проявляли признаков паралича. После второго поколения в группе вакцинированных куриных эмбрионов появились признаки паралича; полевой штамм A впервые вызвал паралич куриных эмбрионов на третьем поколении. После пассажа до 7-го поколения у всех куриных эмбрионов, вакцинированных любым из штаммов, наблюдался паралич. Одновременно средняя масса куриных эмбрионов к 19-дневному возрасту снизилась с 22,5–24,2 г до 15,4–16,7 г. Специфическая летальность куриных эмбрионов, вызванная вирусом птичьего энцефалита и спинномозгистого воспаления, значительно колебалась, но постепенно повышалась с увеличением числа поколений, увеличившись с 3,6–11,1 % в первом поколении до 17,2–35,7 % в седьмом поколении (табл. 3). В контрольной группе с имитацией вакцинации не наблюдалось парализованных куриных эмбрионов, средняя масса куриных эмбрионов составляла от 20,4 до 24,5 г, а уровень подозрительной летальности — 3,6–14,3 %. За исключением 4-го поколения вакцины и 5-го поколения полевого штамма A, средняя масса куриных эмбрионов, вакцинированных остальными поколениями, была значительно ниже, чем в соответствующих контрольных группах (P < 0,05) (табл. 3).

Таблица 3. Показатели паралича, смертности и средней массы на 19-й день развития эмбрионов для каждого поколения 7-го поколения; для каждого типа вируса было инокулировано по 25–30 эмбрионов

У куриных эмбрионов 7-го поколения, инфицированных любым из изолятов вируса, наиболее выраженные гистопатологические изменения наблюдались в головном мозге и проявлялись в виде очаговых кровоизлияний, размягчения, отека, гиперплазии глиальных клеток, неоваскуляризации и минерализации. К числу других патологических изменений относились тяжелая дегенеративно-некротическая деформация скелетных мышечных волокон, выраженная атрофия скелетных мышечных волокон, миокардит и аденогастрит (рис. 1). У куриных эмбрионов из контрольной группы, подвергшихся имитационной инкубации, патологических изменений не наблюдалось.

Рис. 1. Гистопатологические изменения в куриных эмбрионах после инокуляции полевых штаммов вируса птичьего энцефаломиелита (AEV) или вакцинных штаммов, адаптированных к вирусу 7-го поколения. Окраска гематоксилином и эозином (HE).

A1: очаговые кровоизлияния, размягчение и гиперплазия глиальных клеток в головном мозге; A2: очаговый отек, гиперплазия глиальных клеток и неоваскуляризация в головном мозге; B: выраженная атрофия скелетных мышечных волокон; C: выраженная дегенерация и некроз скелетных мышечных волокон; D: миокардит; E: аденовирусный гастрит
Провели определение вирусной нагрузки в головах куриных эмбрионов 1-го, 3-го, 5-го и 7-го поколений, инфицированных полевым штаммом A, вакциной A и вакциной B. В качестве внутреннего контроля использовали РНК куриного β-актина; вирусную нагрузку определяли с помощью количественной флуоресцентной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени. Куриные эмбрионы инфицировали в возрасте 6–7 дней, а анализ проводили в возрасте 19 дней.
Эффективность амплификации вируса птичьего энцефалита и спинномозгистого воспаления (E_AEV) в режиме количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени составила 1,934, а эффективность амплификации β-актина (E_beta-act) — 1,967. Была определена вирусная нагрузка 1-го, 3-го, 5-го и 7-го поколений относительно мРНК β-актина. Вирусная нагрузка между тремя типами вируса и в процессе пассажирования была схожей; лишь в исходном образце, взятом в полевых условиях, вирусная нагрузка была на 1 % ниже, чем в остальных образцах (рис. 2).

Рис. 2. Вирусная нагрузка в головах куриных эмбрионов после инокуляции вирусами 1-го, 3-го, 5-го и 7-го поколений, полученными соответственно из полевого штамма A, вакцины A и вакцины B. Относительное количественное определение вирусной нагрузки проводилось методом RT-qPCR с использованием РНК куриного β-актина в качестве внутреннего стандарта. Куриные эмбрионы инокулировали в возрасте 6–7 дней, а пробы для анализа отбирали в возрасте 19 дней.
3.2 Определение частичных последовательностей гена VP2 и сравнение с опубликованными последовательностями. Филогенетическое дерево, построенное на основе последовательностей РНК, показывает, что все полевые образцы из Калифорнии, штаммы из США, штаммы, выделенные во время вспышки в Южной Корее, штаммы неизвестного происхождения из Саудовской Аравии, а также последовательности двух вакцинных штаммов и 7-го поколения полевых образцов демонстрируют гомологичность более 99,6 % и объединяются в один кластер. Сходство седьмого поколения двух вакцинных штаммов с вышеупомянутыми последовательностями составило 99,4–99,6 %, однако они сгруппировались в один кластер вместе со штаммом Ван Рокеля, адаптированным к куриным эмбрионам, и двумя штаммами из Китая с неизвестным происхождением; сходство этих трех последовательностей с основным кластером составило около 95 %. Последовательности штаммов, выделенных из здоровых кур в Гонконге, из кур с диареей в Венгрии и из больных фазанов в Великобритании, явно дифференцированы, а их гомологичность с основной группой составляет всего 80 % (рис. 3).

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе последовательности 539 нуклеотидов гена VP2. Масштаб отражает количество нуклеотидных замен в каждом сайте; на рисунке указаны приближенные значения вероятности для ветвей с поддержкой более 0,5. Информация о последовательностях и соответствующие регистрационные номера генов приведены в таблице 2.
3.3 Анализ всего генома и маркеры, связанные с адаптацией к куриным эмбрионам. Полученные последовательности (2 вида вакцин, полевой вирус и его 7-е поколение) были сопоставлены с последовательностями американского штамма, штамма Ван Рокеля, а также изолятов из Венгрии и Гонконга. Было обнаружено лишь 2 однонуклеотидных полиморфизма (SNP), связанных с адаптацией к куриным эмбрионам. Один из них расположен в области VP2 на 1120-м нуклеотиде: дикий штамм кодирует глутамин, а адаптированный к куриным эмбрионам штамм — аргинин; другой — в области VP3 на 1408-м нуклеотиде: дикий штамм кодирует сутанин, а адаптированный к куриным эмбрионам штамм — изолейцин (рис. 4). В исходных вакцинах доля чтений, указывающих на адаптацию к куриным эмбрионам, составляла менее 1 % (в вакцине B на 1120-й позиции соответствующих чтений не было); для сравнения, в культивированных линиях 7-го поколения доля таких чтений составляла 18,1–99,2 % (табл. 4). С помощью секвенирования по методу Сэнгера были исследованы образцы мозговой или нервной ткани, взятые из полевых случаев заболевания, а также из полевого штамма A и 1-го, 3-го и 5-го поколений вакцин A и B. Результаты показали, что с помощью этого метода впервые в 5-м поколении были обнаружены мутации, указывающие на адаптацию к куриным эмбрионам (рис. 4).

Рис. 4. Сайты однонуклеотидных полиморфизмов, связанные с адаптацией к куриным эмбрионам. На рисунке выделены два ключевых сайта: слева — позиция 1120 в области гена VP2, справа — позиция 1480 в области гена VP3 (нумерация сайтов соответствует геному американского штамма). Аминокислотная последовательность приведена в соответствии со стандартной последовательностью американского штамма; * обозначает консервативный сайт. Сигнал продукта амплификации полевого штамма B, содержащего второй сайт однонуклеотидного полиморфизма, был слабым, и качество секвенирования не соответствовало требованиям.
Табл. 4. Количество прочитанных нуклеотидов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в геноме, связанных с адаптацией к куриным эмбрионам, определенных в рамках данного исследования

Результаты построения филогенетического дерева на основе частичной аминокислотной последовательности VP2, а также полных аминокислотных последовательностей генов VP3, полимеразы и АТФазы оказались противоречивыми; в целом штаммы из Гонконга и Венгрии демонстрируют заметные различия по сравнению с другими последовательностями (рис. 5).

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное на основе 222 аминокислот гена VP2, полного гена VP3 (245 аминокислот), гена полимеразы (486 аминокислот) и гена АТФазы (326 аминокислот). Шкала отражает количество нуклеотидных замен в каждом сайте; на рисунке показаны значения поддержки ветвей по приближенной вероятности, превышающие 0,5. A: VP2; B: VP3; C: полимераза; D: АТФаза.

4
Обсуждение. Целью данного исследования было установить, была ли недавняя вспышка птичьего энцефалита-спинномозгистита у молодняка кур вызвана непреднамеренной адаптацией вакцины к куриным эмбрионам. Данное сообщение не является первым случаем в литературе, когда описывается вспышка птичьего энцефалита-спинномозгистита у несушек после перорального введения вакцины или вакцинации через крыловую мембрану; во всех этих исследованиях было сложно определить первопричину. Из трёх возможных причин — адаптация вакцины к куриным эмбрионам, иммуносупрессия у молодых кур и неправильный способ вакцинации — только адаптация к куриным эмбрионам может быть подтверждена задним числом. В полевых случаях признаков иммуносупрессии обнаружено не было.
Ни полевой штамм, ни вакцина A, использовавшаяся для зараженного стада, не вызывали патологических изменений в куриных эмбрионах, что указывает на отсутствие адаптации как патогенного штамма, так и вакцины к куриным эмбрионам. Однако почти полное совпадение геномов полевого штамма и вакцины может свидетельствовать о том, что вакцина вызвала клинические симптомы.
С другой стороны, высокая степень сходства полевого штамма и вакцины не может служить убедительным доказательством, поскольку последовательности вируса птичьего энцефалита-миелита во всем мире являются высококонсервативными. Несмотря на то, что известно, что у вируса птичьего энцефалита-миелита нет различных серотипов, чрезвычайно высокая гомологичность фрагментов гена VP2 у большой группы штаммов является весьма заметной. Эти последовательности включают геномы штаммов, предоставленных доктором Карнеком Мавелу и др. (1999). Учитывая роль доктора Карнека в разработке вакцины против птичьего энцефалита, многие из используемых в настоящее время вакцин, скорее всего, происходят от этого штамма, что также объясняет их высокую гомологию с двумя вакцинами, исследованными в рамках данного исследования. Информация о случаях заболевания, связанных с эпидемиями в других странах, пока не опубликована. Однако, учитывая широкое применение вакцин и полную вирулентность вакцинных штаммов, эти случаи, скорее всего, были вызваны вакцинными штаммами. Фактически, различия в последовательностях наблюдались только у невакцинированных кур свободного выгула из Гонконга и Венгрии, а также у невакцинированных фазанов из Великобритании.
При последовательном пассажировании полевого штамма и двух вакцинных вирусов в куриных эмбрионах полная адаптация к куриным эмбрионам была достигнута уже через 7 поколений, что значительно меньше, чем 8–20 поколений, о которых сообщали Бартфилд и др. Это, возможно, связано с тем, что пассажирование уже проводилось в процессе производства вакцины. Уже во 2-м поколении появились первые признаки адаптации к куриным эмбрионам, что свидетельствует о том, что производители вакцин сохраняют небольшой запас безопасности при пассаже штаммов.
Патологические изменения в головном мозге и скелетных мышцах куриных эмбрионов соответствуют данным литературы. Насколько нам известно, ранее не было сообщений о патологических изменениях в сердце и железистом желудке куриных эмбрионов. Аналогичные патологические изменения наблюдались также у цыплят во время полевых вспышек птичьего энцефалита-миелита. Смертность куриных эмбрионов слегка повышена, что не является типичной особенностью адаптации куриных эмбрионов к изолятам вируса птичьего энцефалита-миелита.

За исключением первого поколения полевых штаммов, вирусная нагрузка в процессе пассажа оставалась практически постоянной, что, вероятно, объясняется тем, что вирусная нагрузка в полевых образцах также была низкой. Поскольку этот материал использовался для инокуляции следующего поколения куриных эмбрионов, это также объясняет, почему признаки адаптации полевых штаммов к куриным эмбрионам проявились позже, чем у вакцинных штаммов. С другой стороны, практически постоянная вирусная нагрузка также указывает на то, что адаптация вируса птичьего энцефалита и спинномозгового воспаления к куриным эмбрионам не связана с эффективностью репликации вируса. Существующие исследования подтверждают, что вирус птичьего энцефалита-миелита, адаптированный к куриным эмбрионам, демонстрирует изменения в органотропности у куриных эмбрионов, суточных цыплят и несушек, что, по-видимому, является единственным механизмом адаптации к куриным эмбрионам.
Результаты показывают, что такие изменения органотропности вызваны двумя точечными мутациями в белках VP2 и VP3, что аналогично вирусам Косачи, у которых две точечные мутации в белках VP2 и VP3 изменяют свойства связывания вируса. Для однозначного подтверждения того, что именно эти две точечные мутации являются причиной адаптации к куриным эмбрионам, необходимо ввести эти мутации в неадаптированные к куриным эмбрионам штаммы, а затем заразить ими кур и воспроизвести заболевание. Кроме того, необходимо определить, являются ли обе эти мутации необходимыми для изменения органной тропности или достаточно одной из них.
Секвенирование всего генома показало, что в вакцине A присутствуют обе мутации, тогда как в вакцине B была обнаружена только вторая мутация. Возможно, что эта мутация действительно отсутствовала, а её появление в ходе последующих пассажей стало результатом спонтанной мутации. Однако более вероятно, что содержание этой мутации было крайне низким и не было обнаружено. Существующие исследования показывают, что не все штаммы вируса птичьего энцефалита способны адаптироваться к куриным эмбрионам. Очевидным объяснением является отсутствие соответствующих мутаций в этих штаммах. С практической точки зрения, отбор таких штаммов или их получение посредством очистки по методу плак и реверсивной генетики позволяет создавать вакцины с более высокой степенью безопасности.
В целом, данное исследование показывает, что ни патогенные штаммы вируса птичьего энцефалита и спинного мозга, ни использованные вакцины не прошли адаптацию к куриным эмбрионам. Однако результаты секвенирования указывают на то, что вакцина, возможно, стала причиной недавней вспышки заболевания в Калифорнии вследствие ошибочной инъекции в мышцу или иммуносупрессии у молодых кур. Кроме того, в рамках данного исследования были идентифицированы генетические маркеры, указывающие на адаптацию к куриным эмбрионам (мутации VP2 и VP3), а также оценен риск их возникновения.